Osborne法分級提取五味子蛋白及抗氧化活性比較

王海東，韓榮欣，張紅印，肖鳳琴，于 倩，龐會娜，李光哲，嚴銘銘,2, ，趙大慶

（1.長春中醫藥大學，吉林長春 130117；2.吉林省中藥保健食品科技創新中心，吉林長春 130117）

五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis（Turcz.）Baill的干燥成熟果實，俗稱“北五味子”。五味子用藥歷史悠久，始載于《神農本草經》，具有收斂固澀、益氣生津、補腎寧心之功效[1]。現代藥理研究表明，五味子具有改善代謝紊亂[2]，降低血糖[3?4]、保護肝臟[5]、鎮靜催眠[6?7]、抗氧化[8]等活性，此外，五味子還具有抗衰老[9]、抑制腫瘤生長[10]和免疫調節[11]等作用。

近年來，隨著生活水平的提高，人們對食品的營養健康的關注程度日益增加。蛋白質作為人和動物生命活動主要的能源物質，在人類健康中發揮重要作用。植物蛋白具有資源廣泛、安全穩定、生產成本和毒副作用低等優點，同時植物蛋白表現的一些生物活性也證明其具有較高的利用價值，在生化、醫藥、食品等領域得到了越來越多的認可，因此植物蛋白也成為了當今研究的熱點之一。諸多研究表明[12?13]，中藥的植物蛋白具有顯著的保健功能和藥用功效，如免疫調節、抗氧化、抗疲勞、抗腫瘤等，吸引了諸多領域的研究工作者。許多學者對部分中藥蛋白進行了相關研究，如黃芪[14]、苦杏仁[15]、遠志[16]等，并取得了一定成果。目前，國內外針對五味子的開發利用研究主要集中在木脂素類、多糖類、揮發油類[17?19]等有效成分。本課題組前期對五味子蛋白進行了深入研究[20?24]，結果表明五味子蛋白具有優良的抗氧化活性。

本文基于前期的研究基礎采用Osborne分級法對五味子分級蛋白進行提取，分別研究四種組分蛋白（即清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）的體外抗氧化活性，以Vc作為陽性對照，分析比較同等條件下四種組分蛋白體外抗氧化活性的大小，以期為五味子中四種組分蛋白在健康食品中的廣闊應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

北五味子藥材 吉林省長春中醫藥大學附屬醫院，經長春中醫藥大學姜大成教授鑒定為木蘭科五味子屬植物五味子（Schisandra chinensis）干燥成熟的果實；考馬斯亮藍 R-250、甘氨酸（Glycine）、四甲基乙二胺（TEMED）、十二烷基硫酸鈉（SDS） 分析純，美國sigma公司；鄰啡羅啉（鄰二氮菲）、1,1-二苯基 -2-苦 基 肼 （ 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazylradical，DPPH）、2,2-聯氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽 ABTS（diammonium salt）、維生素 C（抗壞血酸）、蛋白質 Marker（10~180 kDa） 分析純，北京索萊寶生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉、三氯乙酸、鐵氰化鉀、甲醇、乙醇、石油醚等 國產分析純。

Infinite M200 PRO酶標儀 瑞士TECAN公司；MS303S千分之一分析天平、AL204萬分之一分析天平、AB135-S十萬分之一分析天平、S220-KCN標準型pH計 梅特勒-托利多儀器有限公司；S82-2磁力攪拌器 上海志威電器有限公司；HH-6數顯恒溫水浴鍋 金壇市佳美儀器有限公司；PowerPacTMHC電泳儀 美國Bio-rad公司；iBright FL 1000凝膠成像儀 美國ThermoFisher公司；SCIENTZ-50F真空冷凍干燥機 寧波新芝凍干設備股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 五味子脫脂粉的制備 參考文獻[25]的方法，將五味子浸泡24 h，去除果肉后，所得種子清洗干凈放入烘箱內低溫烘干，粉碎過65目篩，按料液比1:5的比例加石油醚（沸程：60~90 ℃），室溫攪拌脫脂24 h，5000 r/min離心10 min得沉淀，待石油醚揮干后過80目篩，得五味子脫脂粉。

1.2.2 五味子蛋白分級提取 參考文獻[26?27]研究方法略作修改，采用Osborne法分級提取五味子蛋白，取揮干后的脫脂藥粉50 g，料液比1:20（w/v）對五味子中的蛋白質進行分級提取。

1.2.2.1 清蛋白提取 取50 g五味子脫脂粉于1500 mL的大燒杯中，加入1000 mL的蒸餾水，室溫攪拌浸提2 h，6000 r/min離心10 min，過濾上清液。合并沉淀再次提取，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，透析48 h，每間隔1 h換水一次，真空冷凍干燥，即得五味子清蛋白。

1.2.2.2 球蛋白提取 將提取清蛋白后的沉淀用1000 mL 1 mol/L的NaC1溶液室溫攪拌浸提2 h，6000 r/min離心10 min，過濾得上清液。合并沉淀后再重復提取一次，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，透析48 h，每間隔1 h換水一次，真空冷凍干燥，即得五味子球蛋白。

1.2.2.3 醇溶蛋白提取 將提取球蛋白后所得沉淀用1000 mL70%（v/v）乙醇提取，室溫條件下攪拌浸提2 h，6000 r/min離心10 min，過濾得上清液。合并沉淀后再次浸提，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，旋轉蒸發濃縮后冷凍干燥，即得五味子醇溶蛋白。

1.2.2.4 谷蛋白提取 將提取醇溶蛋白后的沉淀用1000 mL濃度為0.5 mol/L的NaOH溶液室溫攪拌浸提，室溫條件下攪拌浸提取2 h，6000 r/min離心10 min，過濾得上清液。合并沉淀后再次浸提，操作條件與前者相同。合并兩次所得的上清液，透析48 h，每間隔1 h換水一次，真空冷凍干燥，即得五味子谷蛋白。

1.3 指標測定

1.3.1 原料成分含量測定 水分含量測定：參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》（直接干燥法）；蛋白含量測定：參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》（凱氏定氮法），考馬斯亮藍比色法；脂肪的測定：參照GB/T 5009.6-2006《食品中脂肪的測定》（索式抽提法）；灰分的測定：參照GB 5009.4-2016《食品中灰分的測定》（質量法）。

1.3.2 組分蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍Bradford比色法測定蛋白質含量。牛血清蛋白標準曲線的繪制：各取 0、10、20、30、40、50、60 μL 牛血清白蛋白標準溶液（1 mg/mL），用 PBS 補足到 150 μL 后，加入2.85 mL考馬斯亮藍染液，混勻，室溫放置5 min，在可見-紫外分光光度計595 nm處測定吸光度值，以牛血清蛋白質量（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標繪制標準曲線。稀釋后的樣品溶液用上述方法測定，由標準曲線求得其質量濃度。根據回歸方程，計算4種組分蛋白質的含量：

1.3.3 五味子組分蛋白SDA-PAGE電泳分析 參考 Laemmli[28]、葛環宇等[29]的方法，SDS-PAGE電泳法采用12%分離膠、5%濃縮膠對五味子組分蛋白進行分析，將10 mg/mL的五味子組分蛋白提取液與樣品緩沖液（甘油2 mL，10% SDS 2 mL，溴酚藍0.25 mg，1 mol/L Tris溶液 2.5 mL，β-巰基乙醇 0.5 mL和蒸餾水3 mL）按1:1的體積比例混合，100 ℃煮沸5 min，冷卻至室溫，上樣量10 μL。開始電壓70 V，進入分離膠后140 V，待指示劑遷移至膠前沿1~2 cm處停止電泳。電泳結束后用考馬斯亮藍R-250室溫搖床染色2 h，脫色液脫色數次直至電泳條帶清晰，成像拍照。

1.3.4 體外抗氧化活性研究

1.3.4.1 羥基自由基（·OH）清除能力的測定 通過鄰二氮菲法測定對·OH的作用，樣品組取 1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液和2 mL0.2 mol/LPBS溶液（pH7.4）加入試管，隨后加入 0.1、0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 mg/mL的各組分蛋白樣品溶液1 mL，混勻后加入1 mL 0.75 mmol/L FeSO4溶液，立即混勻，最后加入1 mL 0.025% H2O2溶液，混勻。Vc為陽性對照組，于37 ℃水浴反應1 h后在536 nm波長處測其吸光度值，空白對照組以1 mL蒸餾水代替樣品溶液，樣品對照組以1 mL蒸餾水代替0.025%H2O2溶液，每組試樣做3次平行實驗后取平均值，根據以下公式計算其清除率：

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸光度。

1.3.4.2 DPPH自由基清除能力的測定 五味子各級組分蛋白通過清除DPPH自由基而導致吸光度的減少程度可以測得抗氧化能力。將五味子各級組分蛋白樣品水溶液2 mL加入到具塞試管中，分別在各試管中加入2 mL 0.04 mg/mL DPPH溶液，渦旋混勻。室溫避光反應30 min,于517 nm處測定吸光度值，以2 mL 甲醇代替DPPH溶液作為樣品對照組，以2 mL蒸餾水代替樣品液作為空白對照組。以Vc為陽性對照組，每個處理試樣均做3次平行實驗，取平均值。通過以下公式計算其清除率：

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸光度。

1.3.4.3 Fe3+還原能力的測定 參考文獻[30]的方法，取1 mL不同質量濃度的五味子各級蛋白于具塞試管中，分別加入2.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖溶液（pH6.6）和2.5 mL 1.0%鐵氰化鉀溶液，迅速混勻后于50 ℃水浴反應20 min，冷卻，加入2.5 mL10%三氯乙酸，混勻，3000 r/min離心10 min，取上清2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，充分混勻，以蒸餾水做空白調零，在最大吸收波長700 nm下測其吸光度值，以2.5 mL蒸餾水代替樣品溶液作為樣品對照組，以Vc為陽性對照，每個樣品重復3次,取平均值。通過以下公式計算其還原能力：

式中：A1為樣品組吸光度；A2為樣品對照組吸光度。

1.3.4.4 ABTS自由基測定 參考文獻[31]，稱取一定量的ABTS和過硫酸鉀，用去離子水配制成ABTS濃度為7.4 mmol/L，過硫酸鉀濃度為2.6 mmol/L的溶液，將5 mL ABTS儲備液與88 μL過硫酸鉀混勻作為工作液，室溫下避光靜置12~16 h，臨用前用0.01 mol/L pH7.4 PBS緩沖溶液稀釋至734 nm處吸光度值在0.7±0.2范圍內，測定其吸光度作為空白對照組。將0.2 mL ABTS工作液與10 μL不同濃度的五味子各級蛋白樣品溶液混勻，室溫下避光放置6 min，于波長734 nm處測定吸光度。ABTS自由基清除能力計算公式為：

式中：A0為空白對照組吸光度；A1為樣品組吸光度。

1.4 數據處理

以上所有試驗至少重復3次，數據采用Excel 2016和Origin 2019軟件進行計算繪圖，結果用平均值±標準差來表示。

2 結果與分析

2.1 原料成分分析

根據表1顯示的測定結果，五味子種子中脂肪含量最多，其次是蛋白質，含量為7.82%左右，水分含量相對較少。

表1 五味子種子基本成分分析Table 1 Basic composition analysis of Schisandra chinensis seeds

2.2 五味子4種組分蛋白含量

以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，得到標準曲線方程Y=0.0167X+0.0476，R2=0.9965。結果表明，此方程具有良好的線性相關性。由圖1可知，五味子4種組分蛋白中谷蛋白相對含量最高，達48.39%，高于綠豆中谷蛋白含量，但清蛋白含量遠低于綠豆[25]，球蛋白含量次之（12.71%），醇溶蛋白含量最低，僅有1.75%。

圖1 五味子4種組分蛋白的百分含量Fig.1 Percentage of four components of Schisandra chinensis protein

2.3 五味子組分蛋白SDS-PAGE電泳分析

SDS-PAGE常用于反映蛋白質的分子量（MW）和組成。由圖2知，五味子總蛋白和組分蛋白亞基條帶區別顯著，總蛋白在15~70 kDa內亞基條帶分布明顯，主要有8個亞基，分子量大致為13、16、17、32、37、45、48、65 kDa；清蛋白兩個亞基的分子量大致為18 kDa和46 kDa，球蛋白亞基分子量主要分布在15~25 kDa和35~55 kDa，6個亞基條帶明顯，分子量大致為 17、18、23、25、37、45 kDa；醇溶蛋白在此分子量內未出現條帶；谷蛋白條帶背景較深，在10~40 kDa分子量范圍內條帶也有分布，3個主要亞基分子量大致為16、18和32 kDa。

圖2 五味子總蛋白和不同組分蛋白SDS-PAGE結果Fig.2 SDS-PAGE results of total protein and different components of Schisandra chinensis

2.4 抗氧化活性比較結果

對五味子分離得到的4種組分蛋白進行羥基自由基（·OH）、DPPH自由基、ABTS自由基清除率和Fe3+還原能力進行研究，實驗結果如下所示：

2.4.1 羥基自由基（·OH）清除率能力 ·OH是一種非常容易發生化學反應的活潑自由基，在銅或鐵離子的存在的條件下，可由 O2?·和過氧化氫反應形成。·OH極易與氨基酸、蛋白質、DNA等生物分子發生反應，也可引起脂質過氧化反應[32]，·OH清除率大小可作為評價抗氧化活性的重要指標。

由圖3可知，除總蛋白外，五味子各組分蛋白對·OH自由基的清除能力較弱，雖然各組分蛋白對·OH的清除能力具有濃度依賴性，即隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強，但是清除·OH 的能力依然低于總蛋白。Vc在1.0 mg/mL濃度時對·OH自由基的清除能力趨于平衡，清除率為接近95%。球蛋白和總蛋白在2 mg/mL時對羥基自由基的清除能力趨向于平緩。其中，五味子總蛋白清除能力最高可達59.78%，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白清除率最高能達到5.99%、16.22%、24.24%和25.54%。因此，五味子中各組分蛋白和總蛋白對·OH清除能力大小為：總蛋白>谷蛋白>醇溶蛋白>球蛋白>清蛋白，表明除清蛋白外，五味子其它組分蛋白具有一定·OH自由基清除活性。

圖3 四種組分蛋白對羥基自由基的清除能力Fig.3 Hydroxyl radical scavenging ability of the four component proteins

2.4.2 DPPH自由基清除能力 DPPH自由基清除能力測定簡便、重現性好等優點，被廣泛應用于評價各種天然化合物的自由基清除能力。抗氧化劑對DPPH自由基清除的作用被認為是由于它們的氫化能力，當DPPH遇到供氫物質時，自由基被清除，吸光度降低。

五味子各組分蛋白和總蛋白質量濃度為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/mL 的 DPPH 自由基清除率測定結果見圖4。由圖4可見，在測定濃度范圍內，4種組分對DPPH自由基的清除能力隨著樣品濃度的增大而增強。在樣品濃度為2 mg/mL時，總蛋白和醇溶蛋白清除率趨向于平緩。在4種組分蛋中，醇溶蛋白的清除能力最高，當濃度為2.5 mg/mL時最大值為92.38%，接近于Vc的清除能力。因此，五味子中總蛋白和各組分蛋白對DPPH自由基清除能力大小為：醇溶蛋白>總蛋白>清蛋白>谷蛋白>球蛋白，上述結果表明，五味子組分蛋白中清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中可能含有大量供氫物質，能與自由基反應生成更穩定的產物，終止自由基鏈式反應。表明五味子組分蛋白，尤其是醇溶蛋白，可作為一種很好的DPPH自由基清除劑。

圖4 四種組分蛋白對DPPH自由基的清除能力Fig.4 DPPH free radical scavenging ability of four component proteins

2.4.3 Fe3+還原能力 抗氧化劑使鐵氰化鉀被還原成亞鐵氰化鉀，Fe3+與亞鐵氰化鉀可以發生反應，產生普魯士藍，普魯士藍在700 nm處有強吸收峰，還原力與抗氧化劑的能力成一定正比例，所以吸光度值越大，產生的普魯士藍越多，說明其抗氧化能力越強。

由圖5可以看出，清蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白中醇溶蛋白對Fe3+的還原能力最強，且其還原能力隨蛋白濃度的增大而增大，球蛋白在濃度為2 mg/mL的吸光值為1.143，繼續增加濃度，曲線開始趨于平穩，總蛋白在濃度為0.5 mg/mL時吸光度已經趨向于平緩。Vc對Fe3+還原能力的作用，隨著濃度的增大其還原能力不斷增強。可以看出，Fe3+還原力的作用效果中，醇溶蛋白還原能力最強，總蛋白還原能力最弱。五味子中總蛋白和各組分蛋白對Fe3+還原能力大小為：醇溶蛋白>清蛋白>谷蛋白>球蛋白>總蛋白。

圖5 四種組分蛋白的總還原能力Fig.5 Total reducing power of four component proteins

2.4.4 清除ABTS自由基能力 ABTS法用于測定親水性和親脂性物質的抗氧化能力。硫酸鉀可以催化ABTS生成穩定的綠色自由基。生物活性物質的抗氧化活性可以通過ABTS自由基清除率來評估[33]。

不同組分蛋白和總蛋白ABTS自由基清除能力如圖6所示，4種組分蛋白和總蛋白對ABTS自由基均具有一定的清除作用，且隨著濃度的增加，清除能力逐漸增強。清蛋白與醇溶蛋白清除效果相當，球蛋白與總蛋白的清除效果相當，其中谷蛋白對ABTS自由基的清除能力最優，在2.5 mg/mL濃度時，其清除率已達89.20%，非常接近同濃度的Vc。表明五味子總蛋白和各組分蛋白中谷蛋白是非常優良的ABTS自由基清除劑。

圖6 四種組分蛋白對ABTS自由基的清除能力Fig.6 ABTS free radical scavenging ability of the four component proteins

3 討論與結論

本研究以五味子為原料，采用Osborne分級提取法對五味子4種組分蛋白進行分級提取后進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，并對其進行體外抗氧化活性比較研究。SDS-PAGE凝膠電泳結果中清蛋白和球蛋白條帶分離清晰[34]；醇溶蛋白在此分子量范圍內沒有出現條帶，可能是由于醇溶蛋白采用70%（v/v）乙醇提取，所提取出的成分主要是低分子量的肽類成分；谷蛋白由于采用堿液提取，故背景比較深，其主要含有三個亞基，其分子量分布在15~20 kDa和30~40 kDa，這三個亞基也是組成總蛋白的三個主要亞基。

氧化應激反應對人體衰老和健康具有非常重大的影響，各種因素導致的過量自由基可以引發和加劇多種疾病，因此應用抗氧化劑來維持人體健康具有廣泛的需求。近年來，諸多研究結果表明人工合成抗氧化劑副作用多，影響人體健康，對人體肝、脾、肺均會產生不利作用，甚至會誘發惡性腫瘤等疾病[35]。天然抗氧化劑成分毒性遠低于人工合成的抗氧化劑。因此，天然抗氧化劑的研究受到研究者的青睞，尤其是中草藥提取物的抗氧化作用受到國內外學者的廣泛關注。而抗氧化劑其抗氧化作用方式主要為兩種，一種為直接抗氧化作用方式，另一種為通過還原能力達到抗氧化作用的方式。本文抗氧化活性比較研究結果表明，作為直接抗氧化作用方式的羥基自由基和DPPH自由基活性試驗中，總蛋白較分級蛋白擁有較強的清除能力，表明五味子總蛋白在直接抗氧化作用方面具有良好的抗氧化活性；在通過還原力達到抗氧化作用的Fe3+還原能力的測定試驗中，四種分級蛋白均較五味子總蛋白具有良好的還原能力，綜合比較上述兩種抗氧化方式的抗氧化活性檢測，四種分級蛋白中以谷蛋白較佳；本文通過ABTS自由基清除率的測定發現，谷蛋白對ABTS自由基具有明顯的清除效果，在一定的濃度下其清除效果與Vc接近，同時四種分級蛋白含量測定表明谷蛋白含量最高，為48.39%，綜上表明在五味子組分蛋白中，谷蛋白會是一種具有良好前景的潛在抗氧化劑。

本文通過對五味子分級蛋白抗氧化活性的研究，初步闡明了四種分級蛋白的體外抗氧化活性，為五味子分級蛋白抗氧化作用進一步研究奠定了一定的試驗基礎，為該植物蛋白的深入開發以及在健康食品中的應用提供了理論數據。