22種不同來源信陽毛尖茶的分類比較

張 潔，陳思敏，任小盈，馬存強2,, ，馬冰凇，王子浩

（1.信陽農(nóng)林學(xué)院茶學(xué)院, 河南信陽 464000；2.信陽農(nóng)林學(xué)院, 河南省豫南茶樹資源綜合開發(fā)重點實驗室, 河南信陽 464000；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院, 云南昆明 650201；4.聊城高級財經(jīng)職業(yè)學(xué)校, 山東聊城 252000）

茶葉(Camellia sinensisL.)是世界上最受歡迎的風(fēng)味、功能性的非酒精飲料。消費人群占世界總?cè)丝诘娜种Ｐ抨柮獠铻楫a(chǎn)自中國中部的一種著名烘青綠茶，由茶樹鮮葉經(jīng)攤放、殺青、揉捻、干燥等工序加工而成[1]。在特定地區(qū)規(guī)定采制期內(nèi)加工而成的毛尖茶，由于其優(yōu)良品質(zhì)具有較高的經(jīng)濟收益[2]。一般認為，產(chǎn)自“五云山”（車云山、集云山、云霧山、天云山、連云山）、“兩潭”（黑龍?zhí)?、白龍?zhí)叮┖汀耙徽?何家寨）等特定區(qū)域內(nèi)的明前茶（清明節(jié)前采制的茶）為信陽毛尖茶中的極品[3]。

茶多酚(Tea polyphenols)占茶樹鮮葉干物質(zhì)重的18%~36%，具有抗氧化、抗炎特性，以及降低癌癥和糖尿病幾率、降血脂和抗肥胖等多種生物活性[4]，主要包括兒茶素類(Catechins)、黃酮醇類(Flavonols)、黃酮類(Flavonoids)、花青素類(Anthocyanins)和酚酸類(Phenolic acids)等[5]。其中，兒茶素類為茶多酚的主體成分，占茶多酚總量的60%~80%。在茶葉中共檢出(+)-兒茶素(Catechin, C)、(+)-沒食子兒茶素(Gallocatechin, GC)、(-)-表兒茶素 (Epicatechin, EC)、(-)-表沒食子兒茶素(Epigallocatechin, EGC)等非酯型兒茶素和(-)-兒茶素沒食子酸酯(Catechin galllate,CG)、(-)-表兒茶素沒食子酸酯(Epicatechin gallate,ECG)、(-)-沒食子兒茶素沒食子酸酯(Gallocatechin gallate, GCG)和 (-)-表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin gallate, EGCG)等酯型兒茶素[6]?；诜宇惢衔锝M成及其含量差異，可進行茶葉的分類比較和產(chǎn)地溯源[7?8]。另外，ZHOU 等[9?10]根據(jù)酚類化合物、嘌呤堿以及氨基酸含量組成對普洱茶進行了分類比較。

本研究采用高效液相色譜(High performance liquid chromatography, HPLC)等方法對不同來源的22款信陽毛尖茶茶樣中8種兒茶素、6種黃酮類、2種酚酸、3種嘌呤堿等活性成分以及茶多酚、可溶性糖和游離氨基酸總量等主要品質(zhì)成分進行測定，比較不同采制時節(jié)、產(chǎn)地和等級信陽毛尖茶的品質(zhì)成分差異，為明前茶的識別提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

信陽毛尖茶 以2019年3月至5月天云山、四望山兩地不同采制時節(jié)信陽群體種茶樹鮮葉加工而成的22款特級及其以上的信陽毛尖茶為試驗材料（表1）。根據(jù)產(chǎn)地可分為天云山和四望山；根據(jù)茶葉規(guī)格可分為芽頭、次芽和樓頭三個不同等級；根據(jù)采制時節(jié)可分為明前、雨前和春尾；8個兒茶素標(biāo)品（純度98%）：C、EC、EGC、GC、ECG、CG、GCG、EGCG、沒食子酸、鞣花酸、1,4,6-三-O-沒食子酰基-β-D-葡萄糖(水解單寧，1,4,6-tri-O-galloyl-β-D-glucose,GG） 上海源葉生物科技；6個黃酮類標(biāo)品（純度98%）：槲皮素、山奈酚、楊梅素、蘆丁、花旗松素、木犀草素 成都曼斯特生物科技；咖啡堿、可可堿、茶堿標(biāo)品（純度98%） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈 色譜級，美國Thermo Fisher公司。

表1 22款信陽毛尖茶信息及分組Table 1 Information of 22 Xinyang Maojian tea samples and their grouping

Heraeus Fresco17高速離心機 美國Thermo Fisher公司；JXFSTPRP-24 研磨儀 上海凈信科技；TU-1901 紫外-可見分光光度計 北京普析技術(shù)；1200型HPLC儀 美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要品質(zhì)成分分析 參照《GB 5009.3-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》進行茶葉中水分的測定。以沒食子酸為參照，采用福林酚試劑在765 nm波長下進行茶葉中的茶多酚含量測定[11?12]。采用蒽醌試劑在620 nm波長下進行茶葉中可溶性糖總量的測定[12?13]。游離氨基酸總量采用的茚三酮比色法在570 nm波長下進行測定[14]。

1.2.2 茶湯浸提 茶樣經(jīng)研磨儀研磨，40目篩網(wǎng)過篩后，?20 ℃保存?zhèn)溆?。稱取1.0 g茶葉研磨樣品，加入40 mL甲醇和4 mL鹽酸于圓底燒瓶85 ℃回流浸提90 min，冷卻過濾后，通過甲醇定容至50 mL。0.45 μm尼龍濾膜過濾后用于HPLC檢測[15]。

1.2.3 兒茶素、黃酮類、酚酸和嘌呤堿等活性成分的HPLC定量檢測 參照NIAN等[16]構(gòu)建的茶葉中活性成分HPLC定量檢測方法，采用Agilent1200型HPLC儀連接Poroshell 120 EC-C18色譜柱(4.6 mm×100 mm, 2.7 μm)和C18保護柱(4.6 mm×10 mm, 5 μm)對信陽毛尖茶中的兒茶素、黃酮類、酚酸類以及嘌呤堿等活性成分含量進行定量測定。流動相A為0.261%磷酸、5%乙腈，流動相B為80%甲醇；洗脫梯度程序見表2。柱溫為30 ℃；0~20 min檢測波長為280 nm；20~36 min檢測波長為360 nm；進樣體積為2 μL。

表2 HPLC洗脫程序Table 2 Elution program of HPLC

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 每個茶樣進行三次測定重復(fù)。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析和獨立樣本t檢驗。采用Origin 9.0軟件進行主成分分析(Principal component analysis, PCA)和聚類分析(Hierarchical cluster analysis, HCA)。采用MetaboAnalyst 5.0進行不同采制時節(jié)信陽毛尖茶的偏最小二乘法-判別分析(Partial least squares -discriminant analysis，PLS-DA)。

2 結(jié)果分析

2.1 信陽毛尖茶的PCA、HCA和PLS-DA分析

不同來源的22種信陽毛尖中茶多酚、可溶性總糖、游離氨基酸總量以及兒茶素、黃酮類、酚酸和嘌呤堿含量如表3所示。

表3 22個茶樣中兒茶素、黃酮類、酚酸類、嘌呤堿等主要品質(zhì)成分含量Table 3 Contents of catechins, flavonoids, phenolic acids, purine alkaloids and other main quality components in 22 tea samples

PCA、HCA和PLS-DA等多元統(tǒng)計學(xué)分析（圖1）揭示了采制時節(jié)是影響信陽毛尖茶品質(zhì)成分的主要因素。在PCA中（圖1A），PC1和PC2分別解釋了總方差的32.3%和15.9%，顯示了明前茶與雨前和春尾茶的顯著差異。由于雨前茶在采制時節(jié)上介于明前和春尾之間，部分茶樣與明前茶和春尾茶有一定重疊。HCA（圖1B）同樣能完成大多數(shù)明前茶和春尾茶的層次聚類，顯示了明前茶與春尾茶之間的差異顯著。HCA將23個品質(zhì)成分分為三組。一組（藍色）主要包括山奈酚、木犀草素、C和游離氨基酸總量等品質(zhì)成分，在明前、雨前和春尾等不同茶組中呈下降趨勢；在明前茶中含量最高。二組（綠色）主要包括可溶性糖、茶堿、楊梅素、蘆丁、EGC和EC等品質(zhì)成分，在不同茶組之間保持穩(wěn)定或呈小幅度上升趨勢。三組（紅色）主要包括咖啡堿等嘌呤堿、沒食子酸等酚酸、EGCG和ECG等酯型兒茶素以及槲皮素和花旗松素等黃酮類，在不同茶組中整體呈降低趨勢；在春尾組和樓頭組中含量最高。明前、雨前和春尾茶的PLS-DA（圖1C）中，成分1和成分2分別解釋了總方差的59.5%和16.7%，在95%的置信度內(nèi)能完成明前茶和雨前茶的判別分析。另外，PLS-DA顯示游離氨基酸；兒茶素C、EGC和GC；以及可溶性糖和茶多酚等品質(zhì)成分為采制時節(jié)識別的關(guān)鍵差異物質(zhì)。整體來說，通過多元統(tǒng)計學(xué)分析可基本實現(xiàn)對信陽毛尖茶中明前茶的鑒定識別。同時，也發(fā)現(xiàn)產(chǎn)地和等級差異，對明前茶的鑒定識別有一定的影響。

圖1 不同來源信陽毛尖茶的主成分分析(A)、層次聚類分析(B)和偏最小二乘法判別分析(C)Fig.1 PCA (A), HCA (B) and PLS-DA (C) for Xinyang Maojian teas from various origins

2.2 不同采制時節(jié)信陽毛尖茶的品質(zhì)成分差異

許多研究證實了茶葉品質(zhì)成分的季節(jié)性波動。一般認為，春茶中游離氨基酸含量較高、兒茶素含量適中；相反，夏秋茶中的游離氨基酸總量較低，而兒茶素、黃酮類和花青素類等酚類物質(zhì)大量累積[17?19]。LIU等[20]通過代謝組學(xué)揭示在春季的短時間內(nèi)，茶芽中主要氨基酸呈下降趨勢，而EC、EGC、EGCG、GC和CG等兒茶素呈顯著增加趨勢。明前、雨前和春尾信陽毛尖茶中的品質(zhì)成分含量如表4所示。不同采制時節(jié)的信陽毛尖茶之間在鞣花酸、GG、花旗松素和咖啡堿含量無顯著差異(P>0.05)，在游離氨基酸總量、8種兒茶素、沒食子酸、5種黃酮類和2種嘌呤堿方面存在極顯著差異(P<0.01)。單因素方差分析顯示明前茶中游離氨基酸總量和C含量最高，而GC、EGC、ECG、EGCG、沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素、可可堿含量最低，與明前茶和春尾茶存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)，是明前茶鮮爽度較高的物質(zhì)基礎(chǔ)[20?21]。春尾茶中ECG、EGCG、GCG和CG等酯型兒茶素和GC含量最高，這在一定程度上增加了春尾茶的苦澀度[21?22]。雨前茶中蘆丁、山奈酚、楊梅素等黃酮類含量最高。在茶樹生理中，沒食子酸和黃酮類等是酯型兒茶素合成的前體物質(zhì)[23]。沒食子酸和黃酮類含量的增加為雨前和春尾茶中酯型兒茶素的累積奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。

表4 明前、雨前和春尾信陽毛尖茶的主要品質(zhì)成分含量和差異Table 4 Contents and differences of main quality components in Xinyang Maojian teas among Mingqian,Yuqian and Chunwei

2.3 天云山和四望山毛尖茶的品質(zhì)成分對比分析

由于地理環(huán)境和氣候條件的差異，前人采用HPLC、LC-MS/MS和GC-MS/MS代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)多種與產(chǎn)地識別相關(guān)的差異化代謝物[24?26]。天云山和四望山均位于信陽市浉河區(qū)，兩地自然環(huán)境和氣候條件相近。如圖2所示，兩地之間僅在茶多酚、游離氨基酸總量、非酯型兒茶素總量、黃酮總量和沒食子酸等品質(zhì)成分（圖2A）上存在顯著(P<0.05)或極顯著差異 (P<0.01)。在 8種兒茶素中（圖2B），僅在 C、GC和ECG含量上存在顯著差異(P<0.05)，在其他5種兒茶素，如EGCG含量上無顯著差異(P>0.05)。在6種黃酮類化合物中（圖2C）,在蘆丁、花旗松素、槲皮素和木犀草素含量上存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。相對而言，四望山毛尖茶含有更高的茶多酚和非酯型兒茶素總量以及較低的游離氨基酸總量和黃酮總量。酚類化合物和游離氨基酸總量的差異在一定程度上影響了信陽毛尖茶的香氣、滋味、色澤。

圖2 天云山和四望山毛尖茶中的品質(zhì)成分差異Fig.2 Differences of quality components in teas between Mount Tianyun and Siwang

2.4 不同等級毛尖茶的品質(zhì)成分差異

不同等級綠茶、紅茶在酚類化合物、抗氧化能力、抗溶血活性等方面存在顯著差異[27]。信陽毛尖按照鮮葉分級指標(biāo)共分為珍品、特級、一級、二級、三級和四級等不同的級別[28]。而市場上銷售的信陽毛尖多分為芽頭、次芽、樓頭和芽葉等不同等級。本文參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，將收集到的毛尖茶分為芽頭、次芽和樓頭三個等級。按照鮮葉分級指標(biāo)，這三個等級均以單芽為主，一芽一葉為輔。由于茶葉級別相近，不同等級毛尖茶在茶多酚總量、可溶性糖總量、黃酮總量以及沒食子酸、鞣花酸、EGCG、ECG、咖啡堿、可可堿、蘆丁等品質(zhì)成分上均無顯著差異(P>0.05)，僅在游離氨基酸總量、茶堿、GG(圖3A)、C、EC、EGC（圖3B）、花旗松素、山奈酚、楊梅素（圖3C）等含量上存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。特別是C，在芽頭中含量最高、在次芽中含量次之、在樓頭中含量最低。與EGC在不同等級毛尖茶中的分布相反。這在一定程度上為信陽毛尖茶等級識別提供了參考。

圖3 不同檔次信陽毛尖茶主要品質(zhì)成分含量對比Fig.3 Comparisons of the main quality components in Xinyang Maojian tea among different grades

3 討論與結(jié)論

本課題組之前采用HPLC等方法對景邁和芒景兩地曬青綠茶進行了產(chǎn)地識別，并借助LC-MS/MS代謝組學(xué)初步探究了浉河、商城、羅山所產(chǎn)信陽毛尖茶的代謝組分差異[29?30]。為了探究產(chǎn)地、等級、采制時節(jié)等因素對信陽毛尖茶品質(zhì)成分的影響，本文采用HPLC和紫外-可見分光光度計法對22個不同來源信陽毛尖茶樣中的兒茶素、黃酮類、酚酸和嘌呤堿等20個活性成分以及茶多酚、可溶性糖和游離氨基酸總量等主要品質(zhì)成分進行測定。

PCA、HCA和PLS-DA均顯示了采制時節(jié)是影響信陽毛尖茶品質(zhì)成分的主要因素。信陽毛尖茶基本可按照采制時節(jié)分為明前茶、雨前茶和春尾茶。PLS-DA確定游離氨基酸、兒茶素C、EGC和GC、以及可溶性糖和茶多酚等品質(zhì)成分為信陽毛尖采制時節(jié)識別的關(guān)鍵差異物質(zhì)。單因素方差分析顯示明前茶、雨前茶和春尾茶在游離氨基酸總量、8種兒茶素、沒食子酸、5種黃酮類和2種嘌呤堿等品質(zhì)成分存在極顯著差異(P<0.01)。明前茶中游離氨基酸總量和 C含量最高，CG、ECG、GCG、EGC、EGCG、沒食子酸、蘆丁、楊梅素、槲皮素含量最低，與明前茶和春尾茶存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)；春尾茶中ECG、EGCG、GCG和CG等酯型兒茶素和GC含量最高。這與前人研究結(jié)果基本一致[13?15]。本研究同時也發(fā)現(xiàn)雨前茶中黃酮總量以及蘆丁、山奈酚、楊梅素和沒食子含量極顯著(P<0.01)高于明前茶和春尾茶，這可能與不同采摘時期茶樹生理中酯型兒茶素的合成代謝差異有關(guān)。

相對于采制時節(jié)，由于天云山和四望山地理環(huán)境和氣候條件相近，兩地毛尖茶僅在C、GC、ECG等兒茶素和蘆丁、花旗松素、槲皮素、木犀草素等黃酮含量上存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。不同等級信陽毛尖茶在游離氨基酸、茶堿、GG、C、EC、EGC、花旗松素、山奈酚、楊梅素等含量上存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。這在一定程度上影響了信陽毛尖采制時節(jié)的識別鑒定。