宏基因組二代測序在膿毒癥病原學(xué)診斷中的臨床應(yīng)用*

陳友蓮，劉雪燕，陳懷生，洪澄英，劉曉君

(深圳市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 深圳 518020)

膿毒癥(sepsis)是一種復(fù)雜的臨床綜合征，表現(xiàn)為宿主對感染的反應(yīng)失衡，與急性器官功能障礙和高死亡風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[1]。 在中國，每年約有102.6 萬例患者死于膿毒癥相關(guān)性疾病，占世界膿毒癥總死亡人數(shù)的 19.4%[2]。近年來，隨著膿毒癥診斷及治療方法的進(jìn)步，院內(nèi)患者死亡率雖總體呈降低趨勢[3]，但其發(fā)生率卻持續(xù)升高[4]。目前，膿毒癥病原學(xué)診斷主要包括培養(yǎng)(以細(xì)菌和真菌為主)、血清免疫學(xué)檢測等。其中，血液培養(yǎng)(BC)被認(rèn)為是診斷膿毒癥病原學(xué)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但BC周期較長(3～7 d)，診斷陽性率較低，且并非所有的病原體都能被培養(yǎng)出，使得BC具有明顯的局限性[5]。血清免疫學(xué)檢查也只能檢測幾種特定病原體，顯然不能滿足臨床需要[6]。 宏基因組二代測序(mNGS)是一種新的病原學(xué)檢測方法，其直接從感染樣本中提取所有微生物核酸進(jìn)行高通量測序，具有檢測速度快、準(zhǔn)確率高、覆蓋范圍廣等特點(diǎn)，在臨床病原學(xué)診斷和醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域顯示出良好的應(yīng)用前景[7]。 本研究對血標(biāo)本mNGS與BC2種病原學(xué)檢測方法檢測膿毒癥患者病原體檢出率、檢測耗時及臨床結(jié)局等指標(biāo)進(jìn)行比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2019 年1 月至 2021 年1月本院重癥醫(yī)學(xué)科(ICU)收治的60例膿毒癥患者作為研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床診斷為膿毒癥[8]； (2)首次入住ICU，48 h內(nèi)行BC及mNGS檢測；(3) 患者或授權(quán)家屬知情且同意進(jìn)行mNGS檢測。 排除標(biāo)準(zhǔn):(1)合并晚期惡性腫瘤；(2)近半年內(nèi)接受過免疫抑制劑治療；(3) 妊娠和18歲以下。本研究為回顧性研究，患者記錄數(shù)據(jù)編碼后匿名以保護(hù)患者的隱私，符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則。本研究獲得本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1研究方法 符合納入標(biāo)準(zhǔn)患者進(jìn)入 ICU 后，在靜脈應(yīng)用抗菌藥物抗感染前，嚴(yán)格按照采血流程及規(guī)范，常規(guī)采集雙上肢靜脈血各 10 mL 保存于需氧與厭氧BC瓶中進(jìn)行微生物培養(yǎng)，同時另采集5～10 mL全血樣本，并將其儲存在4 ℃的EDTA管中，由專業(yè)人員及時送往深圳華大基因研究所進(jìn)行mNGS檢測。依據(jù)患者臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室資料及影像學(xué)等資料，經(jīng)主治醫(yī)生綜合評估后給予膿毒癥集束化治療(原發(fā)病治療、液體復(fù)蘇、呼吸循環(huán)支持、營養(yǎng)支持、控制血糖、預(yù)防應(yīng)激性潰瘍、血栓預(yù)防等)。根據(jù)BC及 mNGS 檢測結(jié)果，結(jié)合臨床實(shí)際情況決定是否調(diào)整抗感染藥物。患者在ICU治療結(jié)局包括：死亡、治愈出院或好轉(zhuǎn)后轉(zhuǎn)入其他專科。

1.2.2觀察指標(biāo)及評價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 統(tǒng)計(jì)BC及mNGS檢測病原體例數(shù)、檢出種類、檢測耗時( 檢測耗時是指從采集樣本到出具病原體報(bào)告的時間)、疾病嚴(yán)重程度評估、感染部位分布、器官支持治療措施、抗生素調(diào)整及治療轉(zhuǎn)歸。

2 結(jié) 果

2.1患者基本特征 60例接受BC和mNGS檢測患者基線資料見表1。mNGS陽性組及BC陽性組患者在人口學(xué)特征、疾病嚴(yán)重程度、主要診斷比例等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。60例患者中男 33 例，女 27 例；年齡21～72歲，平均(53.58±17.43)歲；住院時間5～33 d，平均(18.55±14.38) d。感染包括肺部感染12例(20.00%)、腹腔感染30例(50.00%)、泌尿系感染10例(16.70%)、導(dǎo)管相關(guān)性感染 5 例(8.30%)及其他感染3例(5.00%)。呼吸機(jī)支持占比75.00%，血液凈化支持占比58.30%。mNGS檢測耗時較BC短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。所有患者均有抗生素使用史，因病原體檢測結(jié)果調(diào)整抗生素，mNGS占比26.67%，BC占比16.67%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，mNGS陽性組住院時間較BC陽性組短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但兩組28 d死亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 60例患者基線特征及治療轉(zhuǎn)歸情況

2.2病原體分布情況 病原體分布見圖1，mNGS檢測病原體中67.4%為革蘭陰性菌，20.9%為革蘭陽性菌，11.2%為真菌。而BC檢測病原體中70.6%為革蘭陰性菌，11.8%為革蘭氏陽性菌，17.6%為真菌。2種方法檢測出細(xì)菌分布相似，排在首位的是鮑曼不動桿菌，其次是銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌。最常見的真菌感染是念珠菌，其次是曲霉菌。值得注意的是，在17例患者中mNGS檢測到5種病毒，最常見的是巨細(xì)胞病毒(CMV)5例和Epstein Barr病毒5例，其他還包括皰疹病毒3例、細(xì)環(huán)病毒3例、人類細(xì)小病毒B19有1例。

2.3mNGS和BC病原學(xué)檢測效能比較 在60例患者檢測標(biāo)本中，mNGS檢測陽性27例(45.00%)，BC檢測陽性17例(28.33%)，二者均陽性15例(25.00%)，均陰性31例(51.67%)，其中mNGS陽性而BC陰性12例(20.00%)，BC陽性而mNGS陰性2例(3.33%)。mNGS病原體陽性檢出率明顯高于BC，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 mNGS和BC鑒定的病原菌分布

mNGSBC陽性陰性合計(jì)陽性15(25.00)12(20.00)27(45.00)陰性2(3.33)31(51.67)33(55.00)合計(jì)17(28.33)43(71.67)60(100.00)

3 討 論

膿毒癥是困擾重癥醫(yī)學(xué)的主要問題之一，其發(fā)病率和死亡率仍然居高不下[9],給社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[10]。早期識別致病病原體和及時、精準(zhǔn)地使用合適的抗生素是影響患者預(yù)后的關(guān)鍵，特別是在膿毒癥診斷后1 h內(nèi)使用[11]。然而，目前的大多數(shù)方法都是經(jīng)驗(yàn)性的治療，因?yàn)樵谂R床實(shí)踐中很難及時發(fā)現(xiàn)致病病原體。目前臨床上仍是依靠培養(yǎng)技術(shù)來確定病原體，但是，該方法存在著許多不足，如培養(yǎng)鑒定時間較長、陽性率低、部分病原體難以被培養(yǎng)出等[12]。

mNGS是一種廣泛的測序方法，其可以對臨床或環(huán)境樣本的所有基因組[DNA和(或)RNA]進(jìn)行測序。這種技術(shù)可借助從標(biāo)本中檢測到的病原體DNA片段基因序列判斷出感染的致病微生物，檢測靈敏度可以達(dá)百萬分之一；不僅如此，此種方法可將病原體鑒定的時間大大縮短，據(jù)報(bào)道目前最快可在30 h內(nèi)獲得微生物體種類及耐藥性的結(jié)果[13]。

與常規(guī)BC相比，mNGS具有如下優(yōu)點(diǎn)：(1)血mNGS檢測靈敏度明顯提高，導(dǎo)致mNGS敏感度高的原因可能是由于病原體DNA在血漿中存活時間長，抗生素使用對mNGS結(jié)果影響較小，而傳統(tǒng)BC受抗生素的使用影響較大；(2)病原學(xué)符合率高，本研究中只有2例BC陽性而mNGS陰性，病原菌為表皮葡萄球菌，分析原因可能系采血污染所致；(3)檢測時間縮短，具有明顯優(yōu)勢；因病原體明確，行抗生素調(diào)整占比26.67%，mNGS檢測陽性組患者ICU住院時間明顯縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；(4)雖然28 d生存率有改善，但與BC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，這可能與影響膿毒癥生存率原因復(fù)雜及病例數(shù)不足有關(guān)。此外，血mNGS在檢測病毒方面具有非常明顯優(yōu)勢，特別是對一些病毒導(dǎo)致肺炎患者具有重要診斷意義[14]。

但mNGS也存在局限性。首先，外周血 mNGS能靈敏地特異性檢出病原體，也可能檢出定植或非致病性的微生物，造成假陽性結(jié)果，這可能會導(dǎo)致不必要的檢測和不適當(dāng)?shù)闹委焄15]；其次，環(huán)境或人體菌群對微生物基因組的污染、質(zhì)量控制、方法標(biāo)準(zhǔn)化和數(shù)據(jù)解釋，更低的成本和測序時間及簡化的解釋標(biāo)準(zhǔn)也是目前面臨問題[15]。這些缺點(diǎn)極大地限制了mNGS在病原學(xué)鑒定領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。隨著技術(shù)發(fā)展，相信在不久的將來這些問題都可以迎刃而解。

綜上所述，mNGS在膿毒癥患者病原學(xué)早期診斷中具有良好的應(yīng)用前景。