青海湖裸鯉klf2基因的克隆與功能初步分析

閔倩雯， 周其椿*， 熊 偉， 張顯波， 李建光， 曾 圣， 陳飛雄， 楊 興

(1.貴州省農業科學院 水產研究所， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省特種水產工程技術中心， 貴州 貴陽 550025； 3.貴州省水產技術推廣站， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科裸鯉屬，俗稱湟魚。因青海湖特殊的地理及水體環境而使青海湖裸鯉具有無鱗、耐高寒、耐鹽堿、雜食性的生物學特性及很強的適應能力。其肉質細嫩、鮮美，有很高的經濟價值，1964年被水產部列為國家重要的水生經濟動物。近年來，由于自然和人為的因素影響，青海湖裸鯉資源急劇下降。為保護青海湖裸鯉種群資源恢復，多項科學技術研究已取得多方面突破。2011年，青海湖裸鯉救護中心成功完成“青海湖裸鯉淡水全人工養殖技術研究”項目[1]，為開展引進這種高原冷水性魚類積累了技術資料。對青海湖裸鯉展開生殖生理學研究，對解析其性腺發育機制具有重要意義，并可為其人工擴繁和分子遺傳育種研究奠定理論基礎。【前人研究進展】Kruppel樣轉錄因子(klfs)是一類重要的調控因子，參與胚胎發生過程中的各種生物學過程。Klf家族成員的特征是C端鋅指結構為3個連續的Cys2/His2結構分別螯合1個Zn2+組成，其鋅指結構可與DNA分子上的GT盒或CACCC序列結合發揮作用[2]。klf2(Kruppel-like factor-2)是Kruppel家族的重要成員，可參與多種細胞增殖、分化調控；不僅廣泛表達于血管內皮[3]，還表達于心[4]、肝[5]、腎[6]等重要器官，在各種生理和炎癥性疾病及其發病機制中也起著重要的調節作用[7-8]。JHA等[8-9]研究表明，klf2缺陷型小鼠于產前階段死亡，表明klf2基因在胚胎發育過程中的關鍵作用。然而，klf2基因在裸鯉中的功能和作用還未見研究報道。【研究切入點】圍繞青海湖裸鯉卵巢中klf2基因的克隆和功能開展相關研究。以青海湖裸鯉為研究對象，克隆klf2 cDNA全長序列；基于多物種klf2基因的氨基酸序列，應用生物信息學方法比較分析klf2基因的系統進化關系，利用RT-PC和realtime-QPCR檢測青海湖裸鯉各組織klf2基因的表達情況。【擬解決的關鍵問題】首次克隆出青海湖裸鯉klf2 cDNA全長序列，多物種比對構建裸鯉klf2基因的系統發育進化樹。分析裸鯉klf2基因在各組織分布表達情況，以及對于klf2基因在裸鯉性腺中存在的雌雄差異表達，以得出klf2基因在裸鯉卵巢發育過程中可能的調控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗魚

青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護中心引進，在貴州省農業科學院水產研究所試驗基地培育，于自然光周期下在22℃的恒溫循環水系統中飼養。投喂漢業飼料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鯉klf2基因克隆

根據GenBank中報道的相關物種klf2的基因序列，在基因保守區域設計合成簡并引物，對klf2部分基因片段擴增及測序，獲取青海湖裸鯉klf2基因中間部分序列，并通過5′-和3′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)測序驗證及序列比對獲取klf2基因全序列。

1.3 klf2基因的系統進化分析

從NCBI的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載包括人在內的14個物種klf2基因氨基酸序列(表1)，對14個不同物種及克隆的青海湖裸鯉的klf2氨基酸序列，應用MEGA 6.0以NJ法構建系統進化樹。斑馬魚klf17(NP_571798.1)氨基酸序列作為外類群。

表1 不同物種klf2 基因氨基酸序列

1.4 脊椎動物klf2 基因共線性分析

在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)分析構建脊椎動物klf2基因及其相鄰基因圖譜研究。

1.5 青海湖裸鯉klf2 基因組織表達模式分析

解剖24月齡裸鯉，取腦等11個組織于液氮速凍。按照RNAiso Plus操作說明提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，用基因特異引物擴增，檢驗klf2基因在各組織中的分布情況。

1.6 青海湖裸鯉klf2 基因在各時期卵巢中的表達

取3月齡、6月齡、9月齡、12月齡、18月齡及24月齡的青海湖裸鯉卵巢液氮速凍，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA。采用Real-time PCR檢測klf2基因在各時期裸鯉卵巢中的表達情況。管家基因β-actin作為內參，目標基因mRNA的相對表達水平采用公式R=2-△△Ct方法計算[10]，結果表示為Ct值的平均值±標準偏差(Mean±SD)，應用SPSS進行差異顯著性分析，顯著性水平P<0.05。

2 結果與分析

2.1 青海湖裸鯉klf2 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析顯示，青海湖裸鯉klf2全長cDNA序列為2 183 bp，包括5′端249 bp的非編碼區，1 104 bp的蛋白質編碼區和3′端830 bp非編碼區；開放閱讀框編碼367個氨基酸(圖1)。

圖1 青海湖裸鯉 klf2 cDNA全序列及推導的氨基酸序列

2.2 脊椎動物klf2 基因序列對比及系統進化聚類結果

通過氨基酸序列比對，klf2基因在脊椎動物間有高度相似性，具有保守的zf-H2C2_2結構域。從圖2看出，克隆的青海湖裸鯉klf2與人、小鼠、雞、蜥蜴、爪蟾、腔棘魚、斑點雀鱔、紅鰭東方鲀、青鳉、羅非魚、斑馬魚、金魚、金線鲃、鯉魚klf2基因間的氨基酸序列相似性分別為49.8%、49.5%、58.1%、47.0%、59.8%、58.5%、70.9%、68.4%、67.7%、68.5%、85.6%、91.3%、95.1%、93.5%。

圖2 脊椎動物klf2氨基酸序列比對

根據系統進化樹分析結果(圖3)，四足類、人、小鼠、蜥蜴的klf2基因氨基酸序列聚為一支；雞、爪蟾、腔棘魚的klf2基因氨基酸序列聚為一支；魚類紅鰭東方鲀、青鳉、羅非魚、斑點雀鱔、金魚、鯉魚、斑馬魚、金線鲃、青海湖裸鯉的klf2基因蛋白序列聚為一支。

圖3 基于氨基酸序列的klf2系統進化樹

2.3 脊椎動物klf2基因的共線性

共線性分析結果(圖4)顯示，klf2基因與其鄰近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4在人、小鼠、雞、蜥蜴中的共線性高度保守，與爪蟾的calr3、ap1m1、tpm4不共線；在部分魚類中，klf2基因與其鄰近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4高度保守；與腔棘魚的ap1m1、tpm4不共線；與斑點雀鱔、羅非魚和金線鲃tpm4不共線。

圖4 脊椎動物 klf2基因共線性

2.4 青海湖裸鯉klf2 組織表達模式

RT-PCR分析結果(圖5)表明，青海湖裸鯉klf2基因在成魚各組織中表達存在雌雄差異，雌性個體中klf2基因高量表達于卵巢，且在垂體、鰓、心臟、脾臟中存在中量表達，在頭腎、腎中存在微量表達；雄性個體中klf2基因在垂體、鰓、心臟、脾臟、頭腎、腎中存在微量表達。

圖5 青海湖裸鯉klf2 基因組織表達模式

2.5 青海湖裸鯉 klf2基因在卵巢不同發育階段的表達

Real-time PCR分析(圖6)發現，klf2在3月齡、6月齡、9月齡、12月齡、18月齡及24月齡卵巢中均存在表達，隨月齡增大klf2的相對表達量呈增加趨勢，表現為3月齡<6月齡<9月齡<12月齡<18月齡<24月齡，其中，3月齡表達量顯著低于其余處理；在6月齡、9月齡和12月齡持續顯著升高，后期持續高量表達。

圖6 青海湖裸鯉 klf2基因在卵巢不同發育>階段的表達水平

3 討論

研究成功克隆了青海湖裸鯉klf2基因，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2結構域。系統進化樹分析顯示，以斑馬魚klf17作為外類群，克隆的klf2基因與其他脊椎動物的klf2聚為一支，且klf2基因序列同源性最低為47.0%，最高達95.1%。共線性分析顯示，四足類和魚類klf2基因及相鄰基因的共線性較為保守。

klf2作為轉錄因子，在生物的多種信號通路和器官發育中其重要作用。研究結果顯示，klf2在檢測的青海湖裸鯉的多個組織中有表達，說明該基因的功能是多元化的。研究首次在魚類卵巢中對該基因的表達功能研究發現，klf2在整個青海湖裸鯉卵巢發育后期表達持續升高，并在性成熟的卵巢保持較高水平的表達，3月齡雌性青海湖裸鯉卵巢開始進行減數分裂，一般人工養殖條件下24月齡能夠達到性成熟。從卵巢減數分裂起始至卵巢發育成熟，klf2都存在持續升高的表達，說明魚類klf2可能在卵巢發育過程和卵子發生過程都扮演重要角色，但其具體功能和作用機制，還有待進一步研究。貴州省冷水資源量巨大，水質良好，水溫常年穩定在11～25℃，適宜養殖高品質冷水性魚類，十分適宜青海湖裸鯉產業發展。研究結果為進一步了解klf2基因的作用和機理提供了基礎信息，同時為青海湖裸鯉的人工繁殖和遺傳育種提供了理論基礎。

4 結論

采用cDNA末端快速擴增法首次克隆獲得青海湖裸鯉klf2基因全長cDNA序列，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2結構域；其與其他脊椎動物的klf2基因聚為一支，四足類和魚類klf2基因及相鄰基因的共線性較為保守。采用生物信息學對該基因及其編碼蛋白進行預測分析,并采用RT-PCR和實時熒光定量PCR法檢測出青海湖裸鯉各組織klf2基因的差異表達。生物信息學及表達研究分析表明，klf2基因可能在青海湖裸鯉的卵巢發育和卵子發生過程起重要作用。研究結果將為進一步開展klf2基因在青海湖裸鯉卵巢發育的分子調節機理研究中應用提供基礎數據。