對稱性中位取代羥基卟啉熒光檢測水體痕量汞離子研究

呂向菲，陳瑞華，趙永國，陳靜，張瀠心，白天瑜

(1.長安大學 水利與環境學院，陜西 西安 710054；2.中交第一勘察設計研究院有限公司，陜西 西安 710075；3.西安中交環境工程有限公司，陜西 西安 710065)

《關于汞的水俁公約》預示我國將進一步加強對水體中汞污染的治理[1-2]。《“十三五”生態環境保護規劃》也將水體中的汞污染作為重點治理對象，加強水體汞離子的檢測具有重要意義[3-4]。卟啉分子因具有良好的熒光發射特性，對光穩定、量子產率高、Stokes位移大，可作為高靈敏汞離子熒光探針[5-7]。研究擬選用具有對稱性結構的羥基中位取代卟啉，借助其卟啉環的配位作用和環外中位取代的羥基與汞離子相互作用，實現對水體痕量汞離子的熒光檢測。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

4-羥基苯甲醛、苯甲醛、吡咯、丙酸、無水乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、氯化汞、無水硫酸鈉均為分析純，吡咯使用前需重新蒸餾提純。

RE52AA旋轉蒸發儀；S220-F 臺式酸度計；島津Shimadzu UV1800紫外-可見光譜儀；BEQ UZNDX550-FTIR紅外光譜儀；MALDI-TOF飛行質譜儀；FP-550熒光光譜儀。

1.2 兩種對稱性羥基卟啉的合成與純化

使用改進的丙酸合成法合成兩種具有對稱結構的中位取代羥基卟啉[8]。5，15-二-(4-羥基苯基)10，20-二苯基卟啉(P2OH)和5，10，15，20-四-(4-羥基苯基)苯基卟啉(P4OH)，其結構見圖1。

圖1 兩種羥基卟啉的分子結構Fig.1 The molecular structures of P2OH and P4OH

以H2P2-OH羥基卟啉合成為例，合成步驟如下：將100 mL丙酸加入250 mL三頸瓶中，再分別加入2.3 g的對羥基苯甲醛和5.7 mL苯甲醛，加熱攪拌，使二者充分溶解，混合。繼續升溫至丙酸回流。緩慢滴入5.3 mL新蒸吡咯，待溶液變為棕黑色后，用錫紙包裹反應瓶，并繼續維持丙酸回流狀態，反應1.5 h后停止，撤去加熱攪拌裝置，靜置冷卻至室溫。在旋轉蒸發儀上減壓蒸去大部分的丙酸。加入100 mL無水乙醇。將三頸瓶置于冰箱冷藏室，靜置過夜，次日減壓抽濾，用無水乙醇洗滌產物至濾液無色。70 ℃下真空干燥4 h，得1.56 g紫黑色固體。將紫黑色固體溶解，以二氯甲烷和正己烷體積比 4∶6 作為淋洗劑，進行硅膠柱層析分離，收集第三譜帶即為P2OH。

P4OH的合成，需調整4-羥基苯甲醛和吡咯反應量為等摩爾比，合成步驟與P2OH的步驟類似，最終固體產物以二氯甲烷作為淋洗劑，收集第六譜帶。

1.3 兩種對稱中位取代羥基卟啉熒光檢測水體Hg2+

1.3.1 溶液的配制 取0.016 2 g P2OH和0.017 0 g P4OH分別溶解于30 mL CH3Cl3中，以乙醇作為稀釋劑，定容于250 mL的容量瓶中，分別得到 0.1 mmol/L P2OH和0.1 mmol/L P4OH的儲備液，避光冷藏、備用。

配制10 mmol/L的HgCl2溶液，作為Hg2+的儲備液，冷藏備用。

用乙醇和水體積比1∶1的混合溶劑配制醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH=6)。

1.3.2 熒光光譜儀的測試條件 因pH值對檢測體系有較大影響，本研究所有檢測溶液，如無特殊說明，均使用醋酸-醋酸鈉緩沖溶液作為溶劑，定容于10 mL容量瓶中。測試過程中，如無特殊說明，羥基卟啉的濃度均為0.01 mmol/L。在探針的選擇性測試過程中，所有檢測溶液中 Hg2+濃度均為 0.02 mmol/L。為保證檢測效果，所有溶液配制完成后，均需在2 h內進行測試。設定427 nm為熒光激發波長，在550～700 nm的發射波長范圍內采集體系熒光光譜。在此條件下，分別比較兩種檢測體系的選擇性、時間穩定性和pH穩定性。

2 結果與討論

2.1 P2OH和P4OH的合成分析

P2OH和P4OH的合成均選取反應時間短、產率較高的Alder丙酸法，此方法用于合成羥基卟啉，反應簡單、易控制、產率較高。反應完成后，要蒸去至少2/3的丙酸，防止卟啉酸化形成二氫卟啉，分離提純。通過對兩種卟啉進行質譜分析，正離子模式下，顯示較強的[M+H]+峰(見表1)[8-9]，證明卟啉合成成功。分別測試0.1 mmol/L P2OH和P4OH乙醇溶液的紫外-可見吸收光譜(見圖2)，P2OH和P4OH的S帶峰分別位于416 nm和418 nm左右，Q帶在450～700 nm范圍內有4個峰，這些也作為羥基卟啉的佐證。

表1 兩種對稱中位取代羥基卟啉的[M+1]峰Table 1 [M+1] peaks of two symmetricallysubstituted hydroxyporphyrins

圖2 P2OH和P4OH的紫外可見光譜圖Fig.2 UV-Vis spectra of P2OH and P4OH

2.2 兩種對稱中位取代羥基卟啉檢測水體Hg2+

2.2.1 兩種卟啉熒光檢測選擇性比較 分別稱取0.034 55 g K2CO3、0.034 02 g CH3COONa·3H2O、0.027 75 g CaCl2、0.023 81 g MgCl2、0.059 43 g NiCl2·6H2O、0.032 46 g CoCl2、0.043 26 g Mn(CH3COO)2、0.045 87 g Zn(CH3COO)2、0.067 88 g HgCl2、0.069 51 g FeSO4·7H2O、0.042 5 g AgNO3于燒杯中溶解后，配制25 mL 10-2mol/L的金屬離子儲備液。進行選擇性測試時，以醋酸-醋酸鈉緩沖液作為稀釋劑，將金屬離子溶液定容于10 mL容量瓶中。其中，卟啉及重金屬離子濃度分別為 10-5mol/L 和20 μmol/L，在相同熒光測試條件下，檢測體系的熒光光譜變化，結果見圖3、圖4。

圖3 P2OH檢測不同金屬離子的熒光比率變化Fig.3 The fluorescence ratio changes of P2OH bydetecting different metal ions

圖4 P4OH檢測不同金屬離子的熒光變化Fig.4 The fluorescence ratio changes of P4OH bydetecting different metal ions

由圖可知，只有在Hg2+存在下，檢測體系才會發生明顯的變色(由紫色變為黃綠色)。除了Zn2+，Cu2+和Hg2+，大部分金屬離子的I605 nm/I650 nm和I609 nm/I655 nm熒光發射峰強度比值很小。Cu2+體系熒光衰減較快，熒光峰強度不穩定；Zn2+體系雖然有兩個峰，對金屬離子濃度改變不敏感，且其系統無顏色變化，檢測靈敏性低。只有Hg2+檢測體系，既有有效的熒光峰強度，又保證在兩個波長處發射峰明顯的區別，且顯示熒光體系從紫紅變為黃綠色。

2.2.2 P2OH和P4OH熒光檢測痕量Hg2+的靈敏度比較 在0.2～50 μmol/L Hg2+溶液中，分別利用P2OH和P4OH檢測Hg2+，結果見圖5A和圖6A。

由圖可知，隨著Hg2+濃度的增加，P2OH和P4OH在605 nm和609 nm處熒光發射峰的強度升高，在 650 nm 和655 nm處的熒光發射峰的強度降低，導致熒光比率值增加。通過熒光比率值取對數后，對Hg2+濃度的對數值進行擬合，結果見圖5B和圖6B。

圖5 P2OH檢測不同濃度的汞離子Fig.5 The fluorescence detection of Hg2+ by P2OHA.熒光變化圖；B.熒光比率變化擬合結果

圖6 P4OH檢測不同濃度的汞離子Fig.6 The fluorescence detection of Hg2+ by P4OHA.熒光變化圖；B.擬合直線

由圖可知，擬合直線相關系數都在0.99以上，P2OH和P4OH對汞離子的檢測均具有較高的準確性，P4OH的準確性更高，擬合系數達0.998 3。

參考文獻[10]，通過多次檢測空白溶液，計算熒光標準偏差，得到P2OH和P4OH對Hg2+的檢出限見表2。

表2 兩種對稱中位取代羥基卟啉的熒光檢測下限Table 2 Detection limits of two symmetricallysubstituted hydroxyporphyrins

由表2可知，檢出下限總體處于同一數量級，且P2OH的檢出限更低。這主要是P4OH分子中卟啉環外圍中位含有更多的羥基，導致探針分子之間氫鍵作用較強，使其自身更容易聚集導致。

2.2.3 不同pH條件下P2OH和P4OH檢測體系穩定性 選取Hg2+濃度為0.05 mmol/L體系，以pH=6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為基礎，分別使用1 mol/L鹽酸和1 mol/L 氫氧化鈉在酸度計監測下，配制pH在2～10，不同的緩沖體系，作為不同的稀釋劑，測試體系在不同pH值下的熒光光譜變化。記錄P2OH和P4OH檢測體系在 605 nm 和 609 nm、650 nm 和 655 nm 處的熒光強度，得到兩種卟啉的熒光比率值隨pH變化的關系曲線，見圖7和圖8。

圖7 不同pH 條件下P2OH-Hg2+體系熒光變化Fig.7 The fluorescence ratios of P2OH-Hg2+under different pH

圖8 不同pH 條件下P4OH-Hg2+體系熒光變化Fig.8 The fluorescence ratios of P4OH-Hg2+under different pH

由圖可知，P2OH體系在pH值為3～9的范圍內比較穩定，在pH為6時熒光比率值出現拐點；P4OH熒光體系在pH值為2～10的范圍內，熒光比率值穩定。比較兩個曲線發現，當對稱性卟啉環外圍取代羥基數目增加時，檢測體系熒光比率值在上述pH范圍內數值更穩定。尤其當溶液pH值在2～10內范圍內變化，P4OH檢測體系的熒光比率值幾乎保持不變。這是因為P4OH外圍取代羥基存在解離平衡，羥基上氫離子的數目較多，更易平衡體系的酸堿變化，從而增加檢測溶液的pH穩定性。

2.2.4 P2OH和P4OH的時間穩定性比較 選取Hg2+濃度為0.05 mmol/L的檢測體系，連續測定10 min內其溶液的熒光光譜，同時記錄P2OH和P4OH在 605 nm 和 609 nm、650 nm和655 nm處的熒光強度，結果見圖9、圖10。

圖9 P2OH-Hg2+體系時間穩定性Fig.9 The fluorescence ratios ofP2OH-Hg2+ in 10 mins

圖10 P4OH-Hg2+體系時間穩定性Fig.10 The fluorescence ratios of P4OH-Hg2+ in 10 mins

由圖可知，10 min內，P2OH和P4OH的熒光強度基本保持穩定，熒光比率值略有上升。因此，P2OH和P4OH熒光探針在10 min內檢測體系熒光比率值穩定，滿足實際觀測的時間要求。

2.3 P2OH和P4OH與Hg2+的結合性分析

為探明P2OH和P4OH與Hg2+的結合性強弱，利用Gaussian09軟件的B3LYP模式6-31G (d) basis set，對其軌道能量進行計算，并分析meso-羥基及中心N在卟啉軌道中的含量百分比，結果見圖11和表3。

圖11 兩種羥基卟啉的軌道能量圖Fig.11 Orbital energy of two hydroxyporphyrins

卟啉類型—OH在HOMO中的羥基占比/%—OH在LUMO中的占比/%中心N在HOMO中的占比/%中心N在LUMO中的占比/%P2OH0.7030.032 015.06.04P4OH1.230.18814.56.28

當meso-羥基數目增加時，探針分子最高占據分子軌道(HOMO)和最低未占分子軌道(LUMO)的軌道能量均上升，但其禁帶寬度呈下降趨勢。這表明，P4OH分子在檢測過程中更容易被激發。從 —OH及中心N的軌道占比可推測：當探針分子中的meso-羥基數目增加時，其對探針分子的HOMO和LUMO軌道能量的貢獻均有不同程度的上升，meso-羥基取代對HOMO的增加更顯著。這說明隨著meso-羥基數目的增加，外圍羥基作為金屬離子配位點的結合幾率增加，而中心N與金屬離子的配位幾率下降。

3 結論

(1)合成了兩種對稱結構的中位羥基取代卟啉P2OH、P4OH，并利用二者熒光檢測水體Hg2+，檢測體系不但顯示明顯的顏色變化(從紫紅到黃綠色)，而且顯示熒光比率變化。兩種羥基卟啉熒光檢測體系的熒光比率值對數與水體汞離子濃度的對數，具有較強的線性相關性，擬合系數均高于0.99，檢測下限分別達0.039 54 μmol/L和0.052 01 μmol/L。

(2)檢測體系熒光穩定性較強，P2OH和P4OH檢測體系在10 min熒光強度均穩定，且在pH值為3～9范圍內均維持穩定。

(3)軌道計算結果顯示，隨著meso-羥基數目增加，羥基卟啉傾向于通過中位N及卟啉環外圍 —OH 共同結合更多Hg2+，卟啉環外圍中位羥基作為金屬離子配位點的結合幾率增加，而中心N與金屬離子的配位幾率下降。

(4)對水體Hg2+的檢測過程中，P4OH比P2OH顯示了更優異的熒光檢測特性。