氟化鈉暴露誘導的心肌細胞凋亡中死亡受體通路的作用

徐 薇，曹麗婷，石瑞麗，齊瑞芳，郝肖瓊，馬寶慧

(包頭醫學院生理學教研室，內蒙古 包頭 014040)

氟廣泛存在于日常飲用水、土壤和大氣層中，絕大多數以離子的形式存在于人體，是人體所必需的微量元素之一，大多分布在骨骼及牙齒。適量的攝入氟有利于齲齒的防治，還有利于骨骼及神經系統的發育。但如果長期攝入過量的氟化物會導致慢性氟中毒，骨相損傷表現為氟斑牙和氟骨癥[1]，氟也對非骨相造成損傷，如腎、肝、神經系統等[2-3]。氟的累積可對心血管系統造成損傷，導致動脈粥樣硬化、心室舒張功能障礙、缺血性心臟病等[4-5]。慢性氟中毒的發病機制復雜，其造成的心血管系統損傷可能是由于氟影響了心血管系統的信號通路，使心肌細胞的結構或功能發生改變。但目前慢性氟中毒致心肌細胞損傷的具體分子機制仍不明確。

細胞凋亡是一種主動的細胞生理性的自殺行為。細胞凋亡通路包括內源性線粒體介導的通路、外源性Fas介導的死亡受體通路及內質網應激反應介導的信號通路。Fas介導的死亡受體通路可參與多種因素誘導的細胞凋亡。張佳勇等[6]在氟暴露致PC12神經細胞凋亡的研究中發現，Fas、FasL、caspase-8、FADD、caspase-3基因和蛋白表達水平明顯高于對照組，但Bid基因和蛋白表達水平明顯低于對照組，且呈氟暴露劑量依賴性，說明Fas介導的死亡受體通路可能參與了PC12細胞凋亡。Yuan等[7]的結果表明，Fas/FasL介導的線粒體凋亡途徑在鎘誘導的神經元凋亡中起重要作用。但氟暴露是否可通過Fas介導的死亡受體通路引起心肌細胞凋亡仍不明確。本研究通過體外培養H9c2心肌細胞，模擬氟染毒模型，檢測不同濃度的氟化鈉(sodium fluoride，NaF)對H9c2心肌細胞形態、活力及相關基因和蛋白表達的影響，以闡明氟中毒對H9c2心肌細胞凋亡的作用和可能機制，為進一步探討慢性氟中毒致心肌細胞凋亡的分子機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑NaF(分析純，201702)購于天津大茂化學試劑廠；DMEM高糖培養基(Lvn1001)，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS，A1019)，均購于北京利維寧生物科技有限公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)(AR1160)，TUNEL檢測試劑盒(MK1014-100)，DAB顯色試劑盒(AR1025)，均購于博士德公司；TRIzol(15596018)，反轉錄試劑盒(K1622)，胰蛋白酶(25300054)，BCA定量試劑盒(23227)，ECL化學發光試劑(34075)，均購于美國Thermo公司；caspase-8(ab108333)、caspase-3(ab32351)及caspase-1(ab179515)，β-actin(ab8226)，均購于美國Abcam公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(P1200-1)購于索萊寶生物科技有限公司。

1.2 實驗細胞系H9c2心肌細胞，購于北京協和醫學院細胞資源中心國家實驗細胞資源共享服務平臺。

1.3 儀器CO2培養箱，細胞計數板，超速低溫冷凍離心機，NanoDrop-2000微量核酸蛋白定量儀，PTC-100 PCR儀，ELX-800全自動酶標儀(美國Thermo)；7900HT實時熒光定量PCR系統(美國Applied Biosystems)；Tanon4200SF化學成像發光儀(上海天能)；小型垂直電泳槽，電泳儀電源(美國伯樂)；TE2000-U倒置相差顯微鏡(日本Nikon)。

1.4 方法

1.4.1細胞造模 稱取4 mg NaF，溶解于50 mL含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養基中，配制成1.92 mmol·L-1的母液，濾頭過濾后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養基配制不同濃度的NaF處理液，使NaF終濃度為0.24、0.48和0.96 mmol·L-1，以不加NaF作為對照組，各組培養24、48、72 h后，收集細胞待用。

1.4.2CCK-8法檢測NaF對心肌細胞活力的影響 收集對數期細胞，96孔板中每孔加入細胞懸液100 μL，培養24 h后，棄掉舊的培養基，1× PBS輕輕清洗2次，加入含有不同濃度NaF的高糖DMEM培養基，再加入CCK-8試劑(CCK-8試劑 ∶DMEM=1 ∶10)，5 % CO2、37 ℃培養箱中分別培養24、48和72 h后，使用酶標儀于設置波長450 nm下檢測吸光度值。按以下公式計算細胞存活率，細胞存活率/%=[(實驗孔-空白孔)/(對照孔-空白孔)]×100 %。每組5個復孔，實驗重復3次。

1.4.3TUNEL法檢測NaF對心肌細胞形態及凋亡的影響 收集對數期的細胞，在24孔板中放入細胞爬片，并將細胞接種于細胞爬片上，培養24 h后，加入0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF，分別培養24、48和72 h，對照組不含NaF。根據說明書處理細胞后，顯色。蘇木精輕度復染。脫水、透明、封片。用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.4.4Real-time PCR法檢測NaF對心肌細胞凋亡相關基因表達的影響 H9c2心肌細胞培養24、48和72 h后，收集細胞于1.5 mL的EP管中，加入1 mL TRIzol裂解細胞。按照說明書提取總RNA，并測定RNA濃度。根據反轉錄試劑盒說明書對提取的總RNA進行反轉錄，2×real-time PCR Mix說明書對反轉錄的cDNA進行擴增，按照2-ΔΔCt計算基因相對表達水平，以β-actin為內參，引物序列(目的基因與內參基因引物序列)見Tab 1。

Tab 1 The sequence of primers

1.4.5Western blot法檢測NaF對心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響 H9c2心肌細胞培養48 h后，收集細胞于1.5 mL的EP管中，提取蛋白，并用BCA定量試劑盒進行蛋白濃度測定，計算上樣量，加入4× loading buffer，10× 抗氧化劑，混勻，金屬浴中100 ℃反應10 min，使蛋白變性，置于-80 ℃備用。提前制備適宜濃度的SDS-聚丙烯酰胺凝膠，電泳后轉膜，轉膜結束后5 %脫脂牛奶封閉液封閉1 h，1× TBST洗滌3次后，加入一抗4 ℃孵育過夜，孵育完成后回收一抗，用1× TBST洗滌3次后，二抗室溫孵育2 h后，加入發光液，顯色發光，自動成像。用Tanon凝膠成像系統軟件進行結果處理，以β-actin和α-tubulin為參照，用兩者灰度值代表內參蛋白和目的蛋白相對表達水平。

2 結果

2.1 NaF對心肌細胞活力的影響采用CCK-8法檢測H9c2心肌細胞活力的情況。不同濃度的NaF處理H9c2細胞0、24、48和72 h后，測定其對細胞活力的影響。從Fig 1看出，與對照組相比，NaF處理24 h后，細胞活力降低，并且隨NaF濃度的增加，細胞活力也隨之降低；NaF處理48、72 h后，也有相似的變化。由此可以推斷，長期暴露于NaF可抑制H9c2細胞的活力，并且抑制程度與暴露時間及染毒劑量均密切相關。

Fig 1 Effect of NaF on viability of H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.2 NaF對心肌細胞形態及凋亡的影響用不同濃度NaF對同一批H9c2心肌細胞處理48 h后，結果發現，對照組H9c2心肌細胞形態完整，呈長梭形或短柱形，細胞肌原纖維排列整齊，細胞間隙均勻，細胞核內幾乎無顆粒；與對照組相比，隨NaF染毒劑量的增加，細胞密度降低，細胞開始腫脹、變圓，細胞肌原纖維排列雜亂，細胞核內逐漸有顆粒出現；在0.96 mmol·L-1NaF處理后，細胞形態明顯變得不規則，細胞明顯腫脹、變圓，細胞肌原纖維無序排列，并出現大面積的橫紋斷裂，細胞間隙明顯增大，有的貼壁細胞形狀變得更加不規則，細胞核內明顯有顆粒出現。隨NaF濃度的增加，細胞凋亡程度明顯隨之增加(P<0.01)。結果表明，心肌細胞凋亡程度依賴于NaF劑量，見Fig 2。

Fig 2 Morphology and apoptosis of H9c2 cardiomyocytes after 48 hours of NaF A:control group;B:0.24 mmol·L-1 NaF;C:0.48 mmol·L-1 NaF；D:0.96 mmol·L-1 NaF，**P<0.01 vs control group

2.3 NaF致心肌細胞凋亡相關基因表達的影響NaF處理H9c2心肌細胞24 h后，與對照組相比，0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細胞中Fas mRNA表達量明顯增加(P<0.01)；NaF處理48 h后，與對照組相比，0.48 mmol·L-1和0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細胞中Fas mRNA表達量明顯增加(P<0.01)；NaF處理72 h后，與對照組相比，0.24、0.48和0.96 mmol·L-1NaF處理后心肌細胞中Fas mRNA表達量均明顯增加(P<0.05或P<0.01)。結果可見，Fas mRNA表達量隨NaF處理濃度的增加及處理時間的延長而增加，見Fig 3A。與對照組相比，隨NaF濃度及處理時間的增加，caspase-1和caspase-3 mRNA表達量均逐漸增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 3B、C。與對照組相比，NaF處理24、48、72 h后，心肌細胞caspase-8 mRNA表達量明顯增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 3D。

Fig 3 Effects of NaF on the mRNA expression of Fas,caspase-8,caspase-1 and caspase-3 in H9c2 cells after 24,48 and 72 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

2.4 NaF致心肌細胞凋亡相關蛋白表達的影響

2.4.1NaF對心肌細胞Fas蛋白表達的影響 不同濃度NaF處理48 h后，與對照組相比，隨NaF濃度的增加，H9c2心肌細胞Fas蛋白表達量也隨之增加(P<0.05或P<0.01)，見Fig 4。

2.4.2NaF對心肌細胞caspase-8、caspase-1及caspase-3蛋白表達的影響 不同濃度NaF處理H9c2心肌細胞48 h后，與對照組相比，隨NaF濃度的增加，H9c2心肌細胞caspase-8、caspase-1蛋白表達量均隨之增加(P<0.05或P<0.01)；0.48和0.96 mmol·L-1NaF染毒組H9c2心肌細胞內cleaved-caspase-3蛋白表達量明顯增加(P<0.01)，見Fig 5。

Fig 4 Effect of NaF on protein expression of Fas in H9c2 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

Fig 5 Effects of NaF on protein expression of caspase-8,caspase-1 and cleaved-caspase-3 in H9c2 cells after 48 *P<0.05,**P<0.01 vs control group

3 討論

氟的化學性質活潑，是人體常見微量元素之一。

在慢性氟中毒非骨相損傷的研究中發現，氟易與血液中的微量元素鈣、鎂等相結合，使鈣磷代謝平衡紊亂，抑制脫氫輔酶Ⅰ、Ⅱ系統的活性，從而引起一系列的心血管系統疾病[4]，導致嚴重的心功能障礙，如心輸出量降低、出現心律失常和動脈粥樣硬化等[5,8]。研究發現，慢性氟中毒可引起心臟組織的炎癥，對心肌纖維有明顯損傷[9]。Cicek等[10]研究發現，氟中毒會導致心肌代謝、功能和結構均發生一定程度的損傷。本研究結果也顯示，對照組心肌細胞形態規則，呈長梭形或短柱形，肌原纖維排列整齊，細胞間隙均勻；隨NaF染毒劑量的增加，細胞形態明顯變得不規則，逐漸腫脹、變圓，肌原纖維無序排列，細胞間隙也隨之增大，并且隨著NaF染毒劑量及染毒時間的增加，細胞活力降低，這說明暴露于高濃度NaF可明顯損傷心肌細胞，抑制心肌細胞生長。

然而，目前氟中毒對心肌細胞損傷的機制仍不十分明確。大量研究結果表明，過量氟可誘導機體各器官組織細胞凋亡的發生。氟化鈉對成骨細胞的損傷與細胞凋亡相關蛋白表達上調有關[11]，骨骼肌細胞、腎小管上皮細胞的損傷也與細胞凋亡相關蛋白的表達水平上升有關[12-13]。本研究通過TUNEL法檢測發現，不同濃度NaF處理48 h后，NaF染毒組心肌細胞的細胞核內明顯有顆粒出現，即出現了細胞凋亡，且隨著NaF濃度的增加，細胞凋亡明顯增加，表明氟染毒呈劑量依賴性誘導心肌細胞凋亡，引起細胞損傷。這與Yan等[14]的結果一致。

死亡受體通路是細胞外的信號因子與細胞膜表面的相關受體結合，通過一系列凋亡信號的傳導，從而導致細胞凋亡的發生。當Fas介導的死亡受體途徑被激活時，Fas被FasL誘導發生三聚體化，形成連接器蛋白(Fas-associated death domain protein，FADD)，FADD與caspase-8的酶原相結合形成死亡信號誘導復合物(death-inducing signaling complex，DICS)，DICS可導致caspase-8被激活，激活狀態的caspase-8可激活下游的caspase-3，最終導致細胞凋亡的發生。caspase-1參與了白細胞介素1β(recombinant human interleukin-1 beta，IL-1β)的活化和功能，還可減輕各種動物模型中的炎癥反應，并且很可能參與了caspase-8下游的凋亡途徑[15]。Fas/caspase通路參與調控缺氧復氧引起的心肌細胞凋亡[16]。本研究結果表明，隨著NaF染毒濃度和染毒時間的增加，Fas、caspase-8、caspase-1和caspase-3 mRNA和蛋白表達水平也隨之增加，說明在H9c2心肌細胞中，細胞凋亡相關基因的表達與其暴露在NaF中的濃度和時間有關，提示氟化鈉可能通過Fas表達上調參與心肌細胞凋亡。

綜上所述，NaF可誘導H9c2心肌細胞活力下降及細胞凋亡增加，且Fas、caspase-8、caspase-1和caspase-3的基因表達和蛋白表達水平隨NaF染毒劑量的增加及染毒時間的延長明顯上調，提示Fas介導的死亡受體通路可能參與氟誘導的心肌細胞損傷。本研究結果僅從細胞水平探討了氟染毒對心肌細胞的凋亡機制，為地方性氟中毒的預防和治療提供依據。在今后的研究中將從整體水平進一步明確氟化鈉誘導心肌細胞凋亡與Fas通路的關系及具體機制。