雄激素受體基因rs5918762位點多態性與前列腺癌的關系▲

楊建榮 凌凱南 李碧錦 李 軍 季志強 劉菊珍

(廣西壯族自治區江濱醫院泌尿外科，南寧市 530021，電子郵箱：13907869384@139.com)

前列腺癌是男性生殖系統最常見的惡性腫瘤，其發病率具有明顯地區差異，而近年來中國前列腺癌的發病率呈明顯上升趨勢[1]。研究表明，前列腺癌的發生可能與遺傳、環境、性激素等有關[2]，其中遺傳因素在前列腺癌的發生中具有重要作用[3]。此外，前列腺上皮細胞的生長對雄激素具有依賴性，而雄激素的活性主要由雄激素受體(androgen receptor，AR)調控[4]。因此，AR在前列腺癌的發生中也扮演著重要角色。

單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因組水平上單個核苷酸的變異而形成的遺傳標記，其可以調控基因表達,引起蛋白功能變化。目前，AR基因的SNP位點與前列腺癌之間關系的研究報道較少。故我們篩選AR相關SNP位點后，采用高分辨率溶解曲線分析技術檢測前列腺癌患者與健康體檢者AR基因rs5918762位點的基因型，并使用第一代測序Sanger法進行驗證，為闡明AR基因位點rs5918762多態性與前列腺癌的關系提供理論參考。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 選取2015年1月至2019年1月期間就診于廣西江濱醫院泌尿外科和廣西醫科大學第一附屬醫院泌尿外科的85例前列腺癌患者作為前列腺癌組。納入標準：常居廣西5年以上；均經過兩名以上病理科高年資病理醫師閱片證實為前列腺癌；初治患者，未經放療或化療。排除標準：患有其他腫瘤疾病或合并嚴重心肺等嚴重疾病者；有嚴重并發癥或資料嚴重缺失者。另從這兩家醫院體檢中心納入85例同期健康體檢者(男性)作為正常對照組。納入標準：常居廣西5年以上；與前列腺癌組患者無遺傳學關聯性。排除標準：患有其他腫瘤疾病或合并嚴重心肺等嚴重疾病者；血清前列腺特異抗原(prostate specific antigen，PSA)>4 μg/L者。所有受試者均簽署知情同意書，本研究經廣西江濱醫院倫理委員會審批。

1.2 資料收集 收集兩組研究對象的年齡、體質指數、居住地、血清PSA水平，以及前列腺癌患者的臨床分期、前列腺組織Gleason分級(根據世界衛生組織最新標準[5]進行評估)等資料。

1.3 AR基因SNP位點的選擇策略 使用NCBI 的dbSNP數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/)與SNPinfo數據庫(https://manticore.niehs.nih.gov/)篩選AR相關的SNP位點。篩選條件：(1)HapMap中中國人群中最小等位基因頻率≥5%；(2)多態位點位于3′UTR區 ；(3)多態位點之間連鎖不平衡分析提示r2<0.8；(4)位點尚無前列腺癌相關研究和全基因組關聯性研究報告該位點；(5)在NCBI收錄文獻中有引用該位點。最終僅rs5918762位點符合要求。

1.4 標本收集與DNA提取 抽取研究對象清晨空腹肘靜脈血3～5 mL，采用乙二胺四乙酸抗凝后置于-80℃冰箱長期保存待用。采用天根生化科技(北京)有限公司DNA提取試劑盒(批號：OSR-M102)提取全血基因組DNA，進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用紫外分光光度計(日本島津公司，型號：UV-2450)測定260 nm波長的吸光度值，以測定DNA濃度。

1.5 PCR擴增 在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)中搜索AR基因(NM_001348064.1:c.)轉錄本附近序列，然后在NCBI primer-BLAST(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi)輸入FASTA序列，選擇覆蓋rs5918762位點的引物，得到上游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)和下游引物(GTGAGGACGGGCTGTAGAAG)，擴增片段長度198 bp，引物由廣西吉娃娃生物科技有限公司合成。PCR試劑盒購自TaKaRa公司(批號：DRR036A)，根據說明書進行反應體系的配置，反應體系包括SYBR Green Ⅰ mix(2×)5 μL、上游引物(10 μmol/L)0.3 μL、下游引物(10 μmol/L)0.3 μL、cDNA 0.4 μL，滅菌蒸餾水加至10 μL。PCR反應循環條件：95℃預變性5 min，95℃ 30 s，54℃ 30 s，72℃ 40 s，共35個循環；最后72℃ 10 min，4℃保存至取出產物。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，置于-20℃冰箱中保存。

1.6 高分辨熔解曲線分析技術檢測AR基因rs5918762位點基因型 將9 μL PCR產物與1 μL飽和熒光染料(美國Idaho公司，批號：1000rnx)于暗室中依次加入96孔PCR板并混勻，加入1滴礦物油封液面；PCR反應：95℃ 30 s，25℃ 30 s，共1個循環，保持4℃；將96孔板4 000 r/min離心30 min后，放入LightScanner 384高分辨率溶解曲線突變檢測/基因分型分析系統(美國Idaho公司)中，分析溶解曲線，得出rs5918762位點基因型，并與酶切結果相互佐證。AR基因rs5918762位點基因型如圖1，其中紅色曲線代表基因型TT，綠色和藍色曲線分別代表基因型CT和CC。

圖1 AR基因rs5918762各基因型溶解曲線

1.7 一代測序Sanger法驗證 使用PCR產物純化試劑盒(德國QIAGEN公司，批號：28106)純化每個樣本的PCR擴增產物，鏈接到pUC19克隆載體(購自上海吉凱基因生物科技有限公司)上，轉化到感受態大腸桿菌進行擴增，并常溫培養24 h；經過藍白斑法篩選后挑選8個陽性克隆菌斑進行搖菌培養(溶菌肉湯培養基+50 mg/mL氨芐霉素，37℃烘箱培養15 h)后提取質粒DNA，并委托上海生工生物工程有限公司進行Sanger測序，通過NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行序列比對分析。

1.8 統計學分析 使用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用擬合優度檢驗對各組基因進行Hardy-Weinberg平衡檢驗；采用Logistic回歸分析計算各基因型人群患前列腺風險的比值比(odds ratio,OR)及95%CI。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 研究人群的特征 兩組研究對象的年齡、體質指數、居住地差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。85例前列腺癌患者行血清PSA檢測，為(49.96±3.99)μg/mL，正常對照組血清PSA水平為(2.29±0.07)μg/mL。前列腺癌患者臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期分別有4例(4.71%)、41例(48.24%)、21例(24.70%)、19例(22.35%)；Gleason評分≤7分、>7分各32例(37.65%)、51例(60.00%)，2例患者缺失記錄。

表1 兩組研究對象基線資料的比較[n(%)]

2.2 兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率的比較 在兩組樣本中均檢測到位點變化。兩組研究對象在AR基因rs5918762位點上均以TT基因型為主(見表2)，與一代測序Sanger法檢測結果一致。Hardy-Weinberg平衡檢驗顯示兩組的P值均>0.05，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一群體，具有人群代表性，見表2。

兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率差異有統計學意義(χ2=14.155，P<0.001)，其中前列腺癌組AR基因rs5918762位點TC基因型與CC基因型比例均高于正常對照組，而TT基因型比例低于對照組，見表3。與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型者相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型者[OR=8.377，95%CI(1.286，9.729)，P=0.023]、TC基因型者[OR=3.630，95%CI(1.663,7.967，P=0.001)]患前列腺癌的風險增加。

表2 Hardy-Weinberg平衡檢驗[n(%)]

表3 兩組研究對象AR基因rs5918762位點基因型分布頻率的比較[n(%)]

2.3 AR基因rs5918762位點不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較 3種基因型的前列腺患者的血清PSA水平、Gleason評分差異均無統計學意義(均P>0.05)。與攜帶TT基因型患者相比，攜帶CC基因型患者的臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，見表4。

表4 AR基因rs5918762位點不同基因型前列腺癌患者的臨床病理特征的比較[n(%)]

3 討 論

編碼人類AR的基因定位于X染色體的長臂q11-12，由919個氨基酸組成，含有8個外顯子和7個內含子，相對分子量約為111 000[6]。目前有關AR基因多態性與前列腺癌的相關性研究中，AR基因多態性位點主要包括位于第一外顯子區的(CAG)n和(GGN)n三核苷酸重復序列STR位點以及SNP位點[7]。目前多數學者認為，基因多態性可能通過影響AR的表達水平及轉錄活性，從而影響雄激素作用的信號傳導通路，以刺激前列腺上皮細胞的過度增生，進而促進前列腺癌的發生和發展[8-9]。研究表明， AR基因E211G>A多態性與轉移性前列腺癌和雄激素性脫發的發生風險降低相關[10]。還有學者通過生信分析33個前列腺癌風險位點后發現，有1/3的SNP風險區域位于AR結合區域[11]。還有研究顯示，前列腺癌細胞的AR轉錄活性明顯增強，T877A基因突變導致AR轉錄活性增強是去勢抵抗性前列腺癌發生的機制之一[12-13]。以上研究表明，AR基因多個位點的多態性可能參與前列腺癌的發生、發展，但還需要分子生物學實驗進一步驗證。

本研究分析了AR基因rs5918762位點多態性與前列腺癌風險之間的關系，發現與正常對照組相比，前列腺癌組AR基因rs5918762位點TC基因型與CC基因型比例更高，而TT基因型比例更低(P<0.05)；與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型、TC基因型的人群患前列腺癌的風險增加(均OR>1，P<0.05)。這提示AR基因rs5918762位點基因多態性可能與前列腺癌的發病有關，其中攜帶CC基因型、TC基因型的人群患病概率增加。此外，與攜帶AR基因rs5918762位點TT基因型相比，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型的前列腺癌患者臨床分期Ⅲ～Ⅳ期比例更高(均P<0.05)，這提示AR基因rs5918762位點基因多態性可能還與前列腺癌的病情發展有關，攜帶AR基因rs5918762位點CC基因型、TC基因型的前列腺癌患者的病情進展更快，可能預后亦相對更差。

本研究存在一些不足之處：(1)本文的研究對象僅來源于兩家醫院，樣本較少，且為回顧性研究，今后需要開展多中心、大樣本的前瞻性研究，以獲得更為確切、普適性更強的結論；(2)前列腺癌發病是多因素共同作用的結果，1個基因的SNP可能無法完全解釋疾病狀況，只能作為輔助診斷的依據，在今后的研究中應納入多因素綜合分析前列腺癌的發病影響因素。國際“千人基因組計劃”研究結果顯示，在東亞和南亞人群中，AR基因rs5918762位點的C等位基因頻率分別為0.997和0.908，T等位基因頻率分別為0.003和0.092(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/variation/tools/1000genomes/)，由此可見CC基因型在亞洲人群更常見，與本研究結果相反；此外，本研究結果顯示，Gleason評分在AR基因rs5918762位點的TC或CC基因型與TT基因型患者之間不存在差異，這些可能也是上述因素所致。因此，AR基因rs5918762位點在前列腺癌發生和發展中的具體意義，還需要多中心大樣本研究一步證實，而其影響機制也還需要進一步分子生物學實驗驗證。

總之，AR基因rs5918762位點的多態性可能與前列腺癌易感性和疾病發展有關，且攜帶AR基因rs5918762位點的CC或TC基因型者前列腺癌易感性增加，攜帶CC基因型的前列腺癌患者疾病進展可能更快。