儲糧害蟲網翅鱗蟲齒的形態與DNA條形碼鑒定

鄧溫歆 崔紀翔 馮士騫 粟 耘 陳 暄 陳明華 張 濤 李志紅

(1 中國農業大學植物保護學院植物生物安全系 100193) (2 北京市昌平糧食收儲庫 102200) (3 國家糧食和物資儲備局科學研究院 100037)

嚙總目(Psocodea)中部分物種是全球廣泛關注的倉儲害蟲，它們危害儲糧，極大降低了糧食的品質[1,2]。此外，該類害蟲可傳播病原微生物，導致儲糧污染嚴重，并可能導致人類產生過敏反應[3,4]。因此，嚙蟲被認為是全球食品安全的一種生物風險[5]。危害儲糧的嚙蟲主要屬于書虱科(Liposcelididae)的書虱屬(Liposcelis)和竊蟲齒科(Trogiidae)的鱗蟲齒屬(Lepinotus)[6]。截至目前，鱗蟲齒屬已報道12種[7]；其中，網翅鱗蟲齒(LepinotusreticulatusEnderlein)在中國云南省及浙江省已有記錄[8,9]；其在浙江省為野外記錄，在云南省為糧庫環境中的記錄。嚙蟲可隨糧食的運輸而擴散，作為儲糧害蟲防治的基礎性工作，嚙蟲種類的準確鑒定尤為重要。

由于儲糧嚙蟲個體微小、近似種之間的形態差異細微，基于傳統形態學的種類鑒定需要一定的專業知識與技巧[10]。隨著分子生物技術的快速發展，DNA條形碼被運用于生物物種鑒定，基于mtDNA COΙ條形碼，可快速、準確鑒定出未知動物樣品的種類[11]。其中，Folmer等[12]設計了可擴增無脊椎動物mtDNA COΙ基因的通用引物，已被廣泛應用。針對網翅鱗蟲齒，2012年中國農業大學報道了網翅鱗蟲齒在中國的新紀錄[8,9]；此外，Mohammad Arif等[13]基于普通PCR、SYBR Green qPCR以及HDA(helicase dependent amplification)的方法，對網翅鱗蟲齒的COΙ基因進行擴增，更加快速、靈敏地鑒定出該物種。到目前為止，在NCBI網站中，鱗蟲齒屬中包括網翅鱗蟲齒(Lepinotusreticulatus)及帕特鱗蟲齒(Lepinotuspatruelis)兩個物種，共12條mtDNA COΙ基因序列可供下載并使用。除此之外，竊蟲齒亞目中包括竊蟲齒科、跳蟲齒科和鱗蟲齒科均有代表性的物種的mtDNA COΙ基因序列可供下載并使用。

本研究基于形態學與DNA條形碼相結合的方法，對采集自北京市昌平區某糧庫的嚙蟲樣品進行了鑒定，鑒定結果為網翅鱗蟲齒。本研究實現了對網翅鱗蟲齒的快速、準確鑒定，是該蟲在北京地區的首次報道。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

研究所用嚙蟲樣品于2019年6月采集自北京市昌平區某糧庫的準低溫稻谷倉。樣品液浸于100%乙醇，置于-20℃冰箱保存于中國農業大學植物檢疫與入侵生物學實驗室(CAUPQL)。

1.2 儀器與設備

K-400L體視顯微鏡：香港生產；CX31光學顯微鏡：日本生產；EOS500D相機：日本生產；H2O3-PROIII金屬浴儀：北京生產；Q5000核酸濃度檢測儀；Veriti TM 96-well Thermal Cycler (ABI USA)型PCR儀：美國產。

1.3 試驗方法

1.3.1 形態學鑒定 形態學整體照片使用液浸樣品，浸泡在100%酒精中，于OLYMPUS CX31顯微鏡下鏡檢并使用Canon EOS500D進行拍照。細節照片使用活蟲壓制玻片標本，方法為將樣品浸泡于乳酸6 h，充分釋放內容物，取出后用清水漂洗。在載玻片中央滴1滴霍氏液并將樣品置于霍氏液中。在體視顯微鏡下，用解剖鑷整姿后蓋上蓋玻片。靜置10 min，玻片標本于70℃金屬浴上加熱5 min。待自然風干兩周后于OLYMPUS CX31顯微鏡下鏡檢并使用Canon EOS500D拍攝重要形態學特征照片。照片標尺基于ImageJ 1.8.0添加[14]。

相關形態學鑒定特征參考梁飛揚等[8]。

1.3.2 DNA提取 對嚙蟲樣品的基因組DNA提取選用TIANamp Micro DNA Kit試劑盒，參照試劑盒的使用說明進行單頭提取，共提取4頭樣蟲。應用Quawell Q5000核酸濃度檢測儀檢測所提取DNA的濃度和純度，并置于-70℃保存。

1.3.3 PCR擴增及序列測定 選取mtDNA中的COΙ基因作為DNA條形碼進行PCR擴增。擴增引物參考Folmer等[12]，LCO1490(5′-GGTCAATCATAAAGATATATTGG-3′)，HCO2198(5′-TAAACTTCAGG-GTGAAAAAATCA-3′)。PCR反應在Veriti TM 96-well Thermal Cycler型PCR儀中完成。PCR體系選用25 μL體系：2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，前、后引物各1.0 μL 及基因組DNA模板1.0 μL。擴增條件為：94℃預變性3 min，94℃變性30sec-52℃退火30sec-72℃延伸30sec為1個循環，共設置35次循環，72℃補齊10 min，14℃保存PCR產物[15,16]。針對PCR產物，使用1.5%瓊脂糖1×Tris Acetate-EDTA凝膠電泳，使用Gene Green Nucleic Acid Dye為染色劑，選用D2000 Marker為參考條帶長度，在Gel Logic 212 PRO型紫外燈下檢測PCR產物的擴增結果。全部PCR產物由北京進行雙端一代測序。

1.3.4 序列分析 所測序列基于Chromas檢測其質量[17]，并應用MEGA 7拼接并去除引物序列[18]。應用MEGA 7基于MUSCLE將所測序列與同源序列進行比對后剪切至合適長度[20]，上傳剪切后序列至GenBank獲得Accession number。基于NCBI中BLAST功能與nt數據庫進行相似性比對。GenBank中下載網翅鱗蟲齒同屬及相關物種的同源序列(表1)，竊蟲齒亞目中每個屬選取1個物種作為代表，用于系統發育樹分析。由于11條已知網翅鱗蟲齒的COΙ序列之間相似度高于96%，因此隨機選取一條COΙ序列作為該種的代表參與系統發育樹的構建。參考Yoshizawa等[19]，粉蟲齒亞目的嗜蟲書虱和嗜卷書虱被選取為外群用于進行竊蟲齒亞目相關倉儲害蟲的系統發育分析。應用MEGA 7基于Kimura 2-Parameter模型對COΙ序列進行對偶遺傳距離計算，并構建Neighbor-joining(NJ)系統發育樹，設置自我檢測1000次，結果標注于拓撲結構相應節點旁。

表1 網翅鱗蟲齒及相關物種用于系統發育分析的相關序列信息

2 結果與分析

2.1 形態鑒定結果

嚙蟲樣品玻片標本顯示，該樣品雌蟲體長約1 mm(圖1a)。頭紅褐色，胸部和腹部為黃褐色，無單眼和頭蓋縫臂。復眼上具2根剛毛，其中一剛毛僅剩毛窩(圖1b)。內顎葉頂端具2齒，外側為大齒，內側為小齒(圖1c)。該樣品僅具1對前翅，翅脈網格狀，多毛(圖1a,d)，無后翅。后足脛節具2尖刺(圖1e)，跗節3節，第一跗節上無刺。近肛門處，肛側板上具一長剛毛(圖1f)。雌蟲生殖突外瓣發達，具幾根細小剛毛，頂端具一長剛毛(圖1g)，無受精囊。以上形態特征與已有描述相符，基于形態學觀察結果，所采集的嚙蟲樣品可被鑒定為網翅鱗蟲齒。

a成蟲背面觀

b復眼

c內顎葉頂端

d前翅

e后足脛節、跗節

f肛側板

g生殖突外瓣

2.2 分子鑒定結果

PCR產物經凝膠電泳檢測結果如圖2所示，COΙ基因擴增結果條帶清晰，片段長度約為700 bp。

注：M為D2000 Marker，1～4為4頭樣蟲，5為陰性對照

經測序得到長度為683 bp的高質量COΙ序列4條(MW134455-MW134458)。其與已知網翅鱗蟲齒的mtDNA COΙ序列的BLAST結果如表2所示，E value為0，相似度為97.26%～99.24%。基于Kimura 2-Parameter模型對COΙ序列進行對偶遺傳距離計算結果見表3，樣品與已知網翅鱗蟲齒同源序列間K2P對偶遺傳距離范圍最小，為0.012～0.020。在基于鄰接法(NJ)構建的系統發育樹中，4頭嚙蟲樣品均與已知網翅鱗蟲齒樣品聚在同一支(圖3)，能夠與竊蟲齒亞目其他種群明顯區分。基于以上結果，所采集的嚙蟲樣品為網翅鱗蟲齒。

表2 基于COΙ條形碼的嚙蟲樣品與網翅鱗蟲齒的BLAST結果

表3 基于COΙ條形碼的嚙蟲樣品與相關物種對偶遺傳距離計算結果

圖3 鄰接法(NJ)構建嚙蟲樣品及其相關物種系統發育樹

3 討論

網翅鱗蟲齒是一種個體微小、短翅、能夠孤雌生殖的倉儲害蟲[21-23]，也能在室外的地面垃圾、鳥類及哺乳動物巢中，甚至鳥類羽毛中偶然發現該蟲[9]。本研究基于形態學鑒定方法，對采集自北京市昌平區某糧庫的嚙蟲樣品進行形態學觀察，并對其形態學特征進行了詳細描述，樣品被鑒定為網翅鱗蟲齒。同時，基于DNA條形碼鑒定方法，嚙蟲樣品的mtDNA COΙ條形碼序列被測定，比對了相似度，并被基于Kimura 2-Parameter模型計算對偶遺傳距離，構建了系統發育樹。最終，分子鑒定結果支持形態學觀察結果，即所采集的嚙蟲樣品是網翅鱗蟲齒。

DNA條形碼技術依據簡短且標準化的基因序列進行物種鑒定，其準確性的高低取決于已有基因庫的豐富程度[24]。mtDNA COΙ作為一種典型的模式條形碼，已較為廣泛地用于未知物種的分子鑒定[23]。鱗蟲齒屬的不同種類間，由于蟲體微小，形態特征差異細微，形態鑒定有較大難度。DNA條形碼鑒定可以克服嚙蟲處于不同生長階段，形態特征差別細微所導致的鑒定困難，即能夠快速、準確地鑒定各蟲態的嚙蟲樣品。

到目前為止，在NCBI網站中，鱗蟲齒屬僅有12條mtDNA COΙ基因序列可供下載與使用。在GenBank及BoldSystems等多種數據庫中，所包含鱗蟲齒屬的mtDNA COΙ序列具有一定的重合，但仍有部分序列未同步。此外，數據庫中上傳的mtDNA COΙ基因序列之間長度不一致，這可能為鱗蟲齒屬的準確鑒定帶來不便。為進一步提高DNA條形碼鑒定結果的準確性，隨著鱗蟲齒屬在世界范圍內新紀錄的增加，應盡量增添該屬不同種和種群的mtDNA COΙ序列檢測結果，同時統一序列長度范圍并在多數據庫中同步更新，以提高多數據庫中該基因的豐富程度。

針對網翅磷蟲齒的生物學特性、危害特點以及在糧庫中的發生規律和致害機制，有待進一步研究。在本研究中，網翅磷蟲齒被發現于經過熏蒸的準低溫稻谷倉中。有學者曾針對其食物偏好性及種群增長特點進行過報道[23]。為了實現儲糧嚙蟲的綠色可持續防治，未來應進一步加強網翅磷蟲齒對熏蒸劑和低溫的耐受能力及其機制的研究。