急性髓系白血病患者WT1基因表達水平及其在微小殘留病灶監測中的臨床意義

寧 可，王海峰，徐 莉，李麗寧

(1.西北大學附屬醫院 西安市第三醫院檢驗科，陜西 西安 710018；2.空軍軍醫大學西京醫院血液內科，陜西 西安 710032)

急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是一種常見的血液系統腫瘤，約占成人急性白血病的60%～70%[1]。盡管化療方案不斷完善和各種新藥相繼出現，AML患者無病生存率和總生存時間也不斷提高，但是疾病復發仍是治療失敗、影響患者長期生存的主要原因。白血病患者復發的根本原因是體內微小殘留病灶(Minimal residual disease，MRD)的存在，患者能否長期生存與其關系密切，因此監測MRD對于AML患者療效評估、預后指導和個體化治療具有重要意義。實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RQ-PCR)因靈敏度高、特異性強，可以用來檢測AML特定融合基因，已經成為臨床上監測MRD的常用手段[2-3]，但是超過50%的AML患者無特異性分子生物學標志，治療后無法用RQ-PCR監測MRD。為了尋找基因中AML的預后指標，進而連續監測和動態觀察AML患者的病情變化，國內外許多學者開始研究WT1基因。最早WT1基因是從兒童腎臟腎母細胞瘤中分離出來的腫瘤抑癌基因，位于11p13，由10個外顯子組成，長度約50 kb。研究[4-6]發現，WT1基因是調控造血細胞增殖和分化的轉錄抑制劑，可能在惡性血液系統疾病的發生中起重要作用，尤其在大部分AML呈高表達，而在正常骨髓中少量表達或者不表達。因此，WT1基因較早地被認為是“泛白血病”基因標志，很有希望成為無特異融合基因標記的AML患者MRD監測靶點[7-11]。本研究采用RQ-PCR技術檢測AML患者體內WT1基因的表達情況，分析WT1與AML分型及臨床病程之間的關系，探討其作為MRD監測AML預后的意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2016年1月至2018年12月空軍軍醫大學西京醫院血液內科收治的初發AML患者59例(AML組)，其中男性37例，女性22例；年齡15～69歲，中位年齡49歲。所有患者的診斷均符合FAB分型和WHO 2016年血液系統腫瘤診斷標準，經骨髓形態學、免疫學、細胞遺傳學及分子生物學檢測等確診。另選取同時期就診的骨髓分類正常的16例患者作為對照組，其中男性11例，女性5例；年齡23～65歲，中位年齡44歲。兩組患者一般資料比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。所有患者均未發現其他惡性腫瘤或傳染性疾病。

1.2 基因表達水平檢測 取EDTA-Na2抗凝的患者骨髓標本4 ml，加入紅細胞裂解液裂解紅細胞后，2000 r/min離心5 min，得到白細胞沉淀，然后用TRIzol法提取細胞總RNA，加入焦碳酸二乙酯(DEPC)水混勻溶解。以此RNA作為PCR反應模板，使用美國安捷倫公司的熒光定量RCR儀(Mx 3000p)檢測AML患者各階段WT1基因及相關基因(AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11)mRNA表達水平，內參基因選用ABL(所有基因定量檢測試劑盒均購自上海源奇生物技術有限公司，批號分別是AML-ETO基因(CA100008)、PML-RARa基因(CA100012)、CBFβ-MYH11基因(CA110010)、WT1基因(CA000022))。同時檢測各基因標準品和患者樣本。每次實驗均以ABL基因作為陽性對照，各基因的陰性標本作為陰性對照，保證實驗結果的真實有效可靠。基因表達水平計算：目的基因拷貝數/ABL拷貝數×100%。

1.3 細胞遺傳學檢查 培養患者初發時骨髓細胞，24 h后加入秋水酰胺使分裂細胞停止在分裂中期，制備染色體標本，應用G顯帶技術，在油鏡下分析20個分裂中期細胞。根據《國際人類細胞遺傳學命名法(ISCN)2005》描述異常核型。

1.4 統計學方法 采用SPSS 12.0統計學軟件進行分析。WT1及相關基因表達水平以M(P0，P100)表示，組間比較采用秩和檢驗。各基因間相關性分析采用Pearson法。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者WT1基因表達水平比較 對照組骨髓WT1基因表達水平為0.21%(0%，0.53%)，AML組骨髓WT1基因表達水平為43.32%(0.56%，98.06%)，AML組WT1基因表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。結合臨床經驗和文獻資料，將WT1閾值設為WT1 mRNA≥0.60%[2]。

2.2 不同臨床特征AML患者WT1基因表達水平比較 見表1。不同年齡、性別及白細胞計數AML患者WT1基因表達水平比較，差異無統計學意義(均P>0.05)。FAB分型中，M3與M4型患者WT1基因表達水平較高，但兩者比較差異無統計學意義(P>0.05)；與M2型患者比較，M3型患者WT1基因表達水平較高，M5型患者WT1基因表達水平較低(均P<0.05)；M5型患者WT1基因表達水平亦低于M4型患者(P<0.05)。

表1 不同臨床特征AML患者WT1基因表達水平比較(%)

2.3 不同核型AML患者WT1基因表達水平比較 見表2。異常核型檢出率為64.4%(38/59)，異常核型患者WT1基因表達水平高于正常核型患者(P<0.05)。在38例異常核型AML患者中，核型包括復雜核型、t(8；21)/AML1-ETO、t(15；17)/PML-RARa、t(16；16)/CBFβ-MYH11四種類型。t(15；17)/PML-RARa和t(16；16)/CBFβ-MYH11患者WT1基因表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)。復雜核型和t(8；21)/AML1-ETO患者WT1基因表達水平低于t(15；17)/PML-RARa患者(均P<0.05)。

表2 不同核型AML患者WT1基因表達水平比較(%)

2.4 AML患者WT1與AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因表達水平相關性分析 急性早幼粒細胞白血病(APL)是AML的一種特殊亞型，靶向藥物全反式維甲酸、三氧化二砷聯合常規化療使得APL成為可被治愈的急性白血病，因此本研究僅將AML1-ETO、CBFβ-MYH11基因作為研究對象。將11例AML伴AML1-ETO患者治療前后標本51份與3例AML伴CBFβ-MYH11患者治療前后標本10份進行RQ-PCR。病例跟蹤結果包括持續緩解和血液學復發兩種情況。AML1-ETO陽性患者中，持續緩解的6例患者30份標本AML1-ETO與WT1基因表達水平呈正相關(r=0.76，P<0.05)；4例血液學復發患者治療前后15份標本WT1與AML1-ETO基因表達水平呈正相關(r=0.81，P<0.05)；而有1例血液學復發患者6份標本AML1-ETO升高而WT1基因未升高，仍在初始表達水平(1.27%)附近浮動，且兩者沒有相關性。CBFβ-MYH11陽性患者中，CBFβ-MYH11與WT1基因表達水平呈正相關(r=0.74，P<0.05)。

3 討 論

AML是一種高度異質性疾病，不同FAB亞型有不同的治療效果，即使相同亞型也可能出現截然不同的疾病轉歸，因此監測MRD對于識別高危患者、了解疾病緩解程度和預測早期復發具有十分重要的意義。MRD定期監測及評估是白血病治療過程中的重要一環。熒光原位雜交、流式細胞術和RQ-PCR都可以進行MRD檢測，但目前RQ-PCR是敏感度較高的一項技術，可以達到103～105，在臨床上通常作為診斷和監測MRD的金標準[3，12]。但是急性白血病分型較多，擁有特異性融合基因的相對有限，除了部分含有AML1-ETO、PML-RARa、CBFβ-MYH11等融合基因外，仍有50%～60%患者并不表現出特異性的分子生物學及細胞遺傳學異常[13]，這些患者治療效果的評價及治療后MRD的監測相對比較困難，因此尋找新的分子靶點變得尤為重要。研究[6，13-17]發現，WT1幾乎在所有的白血病中都有表達，尤其在超過70%的AML中高表達，被認為是一種潛在的血液學腫瘤MRD標志物，并且有望用于疾病診斷、預后判斷及MRD監測。

本研究通過比較不同臨床特征AML患者WT1基因表達水平發現，WT1基因表達水平高低與AML患者初發時的年齡、性別以及發病時的白細胞計數沒有明顯相關性。關于AML各亞型之間WT1基因表達水平的高低，目前普遍認為M3型患者WT1基因表達水平最高，M5型表達水平最低[18-20]。本研究結果顯示，M3與M4型患者WT1基因表達水平較高，但兩者比較差異無統計學意義；與M2型患者比較，M3型患者WT1基因表達水平較高，M5型患者WT1基因表達水平較低；M5型患者WT1基因表達水平亦低于M4型患者。也有學者認為各亞型WT1基因表達水平比較都無統計學差異，各家統計結果之間不一致的原因可能是樣本量不夠大，也有可能是在AML診斷方面存在偏差。與此同時，異常核型患者WT1基因表達水平高于正常核型患者；t(15；17)和t(16；16)核型AML患者WT1基因表達水平比較差異無統計學意義；復雜核型和t(8；21)患者WT1基因表達水平低于t(15；17)患者。

我們跟蹤觀察了11例 AML1-ETO陽性AML患者51份標本和3例CBFβ-MYH11陽性AML患者10份標本WT1及AML1-ETO、CBFβ-MYH11融合基因表達水平的變化，發現除1例AML1-ETO復發患者AML1-ETO水平顯著升高，WT1表達水平始終在初始水平附近，沒有提示復發外，其他病例WT1變化情況均與疾病發展呈正相關。因為這例患者初診時WT1基因呈低水平表達(WT1基因初始表達水平1.27%)，能否將低水平表達的WT1基因作為監測MRD的指標還需要大量的樣本驗證。本研究通過比較完全緩解和復發AML患者WT1基因表達水平變化情況也進一步證實，對那些無特異性分子生物學標志的急性白血病來說，WT1基因可以作為白血病細胞的特異性標志監測MRD[6-7，21-22]。

綜上所述，采用RQ-PCR檢測WT1基因表達水平，可以監測AML患者MRD、評估治療效果、預后以及預測疾病復發風險。