半乳糖凝集素-1對高氧誘導急性肺損傷新生鼠的保護作用及機制研究

李萌萌，王 寧

(西安大興醫院兒科，陜西 西安 710016)

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)指由各種直接或間接致傷因素引起的肺泡組織損傷，可導致急性低氧性呼吸功能不全，嚴重者可發展為急性呼吸窘迫綜合征(Acute respiratory distress syndrome，ARDS)，并最終導致患者多器官功能衰竭甚至死亡[1-2]。其發病機制尚不明確，目前較為公認的機制為各種因素誘導肺內大量炎癥因子激活和釋放，從而導致肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞受損，肺內皮細胞通透性增加，引發肺水腫，進而影響肺換氣效能[3]。目前臨床對ALI的治療方案主要通過機械通氣以維持氧供，并給予表面活性劑、糖皮質激素、抗生素及抗氧化劑等對癥治療，并無特效藥物[4]。半乳糖凝集素-1(Galectin-1，Gal-1)是凝集素超級家族中的重要成員，在心、腦、肺、腎、淋巴結等多種組織器官，以及內皮細胞、巨噬細胞、骨髓基質細胞等不同類型細胞中均廣泛表達，在細胞黏附、細胞生長、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤轉移等眾多生理病理過程中均發揮重要作用[5-6]。研究[7-8]發現，Gal-1呈現獨特的抗炎和抗氧化應激作用，因此本研究將Gal-1用于高氧誘導的ALI大鼠的治療，觀察其對肺損傷大鼠肺組織的保護作用，并探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 足月新生Wistar大鼠30只，由南京青龍山動物繁殖場提供，許可證號為SCXK(蘇)2019-0906，飼養于恒溫(21～26 ℃)、恒濕(45%～65%)的潔凈動物房內，間隔12 h日夜循環，給予自由進食、飲水。

1.2 主要試劑 Gal-1(批號：1152-GA/CF)購自美國R&D公司；4%多聚甲醛溶液(批號：180813)購自康迪斯化工(湖北)有限公司；活性氧(ROS)檢測試劑盒(批號：190725)購自武漢富鑫遠科技有限公司；BCA蛋白檢測試劑盒(批號：A72430FA9)購自上海吉至生化科技有限公司；總RNA提取試劑盒(批號：WXBC8980V)購自上海吉至生化科技有限公司；TRIzol試劑(批號：50175111)購自美國賽默飛世爾科技公司；反轉錄試劑盒(批號：00217889)購自美國Fermentas公司；核因子E2相關因子2(Nrf2)、 血紅素氧合酶-1(HO-1)、醌氧化還原酶-1(NQO-1)、 磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(pAMPK)、腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)等試劑盒購自美國Invitrogen公司；酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(批號：E-EL-0033c)購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模、分組及給藥方案：將30只足月新生Wistar大鼠隨機分為對照組、高氧組和高氧+Gal-1組，每組10只。對照組大鼠自由呼吸常壓空氣。高氧組和高氧+Gal-1組大鼠置于玻璃材質高氧箱中，底部鋪入鈉石灰以吸收箱內CO2，保持CO2濃度<0.5%，持續向箱內通入醫用氧氣，用測氧儀每日檢測氧濃度3次，確保其中氧濃度≥85%。高氧+Gal-1組大鼠在置于高氧箱前1 h腹腔注射3 μg Gal-1溶液。各組大鼠均在實驗開始12 h以后處死，進行取樣分析。

1.3.2 組織學觀察：處死大鼠后，取部分左肺組織置于4%多聚甲醛溶液中室溫放置48 h，脫水、包埋、制作石蠟切片后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察組織形態。

1.3.3 肺干濕比(W/D)測量：以4 ℃ PBS緩沖液緩慢沖洗肺循環，分離左肺后迅速稱重，記錄濕肺重量。將濕肺置于80 ℃烘箱中烘干72 h后再次稱重，記錄干肺重量。最后，計算W/D值。

1.3.4 支氣管肺泡灌洗液(BALF)采集：處死大鼠后，通過氣管向肺內緩慢注入4 ℃ PBS緩沖液1 ml，再緩慢抽出，反復3次，最后一次抽出的液體即為BALF，在4 ℃下以1500 r/min離心10 min，取上清-80 ℃凍存備用。

1.3.5 BALF中炎癥因子測定：采用ELISA檢測BALF中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)和白介素-6(IL-6)的表達水平。

1.3.6 ROS、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)測定：取部分左肺組織，稱重后加入PBS緩沖液制備成10%勻漿，4000 r/min離心10 min。取上清，采用熒光酶標儀檢測ROS表達水平，采用黃嘌呤氧化酶(XOD)法檢測SOD濃度，采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測MDA濃度。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.7 Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA檢測：采用TRIzol試劑提取肺組織RNA，用反轉錄試劑盒將總RNA反轉錄為cDNA文庫，以β-actin為內參，計算各個基因的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 各基因引物序列

1.3.8 Nrf2、AMPK蛋白表達檢測：取部分肺組織，PBS洗滌3次，剪碎后過200目鋼篩研磨。收集研磨后的肺組織加入裂解液，提取組織中總蛋白，按試劑盒說明書采用Western blot測定各蛋白表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS 22.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用t檢驗或方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 三組大鼠肺組織病理學形態比較 對照組大鼠肺組織結構規則完整，肺泡大小一致、間隔均勻，無水腫肺泡，無炎性細胞浸潤。高氧組大鼠肺組織結構紊亂，肺泡管腔增大，肺間質呈現充血或出血樣改變，有大量纖維滲出或炎性細胞浸潤。高氧+Gal-1組可見少量纖維滲出或炎性細胞浸潤，肺泡損傷程度介于對照組和高氧組之間。

2.2 三組大鼠肺W/D值比較 見圖1。與對照組相比，高氧組肺W/D值明顯升高(P<0.05)。而高氧+Gal-1組大鼠因使用Gal-1預處理，肺W/D值低于高氧組(P<0.05)。

2.3 三組大鼠炎癥因子表達水平比較 見圖1。高氧組大鼠BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平顯著高于對照組，而經Gal-1預處理的高氧+Gal-1組大鼠TNF-α、IL-1β和IL-6的表達水平則顯著低于高氧組(均P<0.05)。

注：與對照組相比，*P<0.05；與高氧組相比，#P<0.05

2.4 三組大鼠ROS、SOD、MDA表達水平比較 見表2。高氧組大鼠肺組織中ROS和MDA的表達水平顯著高于對照組，SOD的表達水平顯著低于對照組(均P<0.05)。用Gal-1預處理的高氧+Gal-1組大鼠ROS和MDA的表達水平顯著低于高氧組，SOD的表達水平顯著高于高氧組(均P<0.05)。

表2 三組大鼠ROS、SOD、MDA表達水平比較

2.5 三組大鼠Nrf2、 HO-1、NQO-1 mRNA表達水平比較 見圖2。與對照組和高氧組相比，高氧+Gal-1組大鼠肺組織中Nrf2 mRNA的表達水平顯著升高(均P<0.05)。另外，高氧+Gal-1組Nrf2下游基因HO-1和NQO-1的表達水平也顯著高于對照組和高氧組(均P<0.05)。

2.6 三組大鼠pAMPK/AMPK和Nfr2蛋白表達水平比較 見圖3。高氧+ Gal-1組pAMPK/AMPK表達水平顯著高于對照組和高氧組(均P<0.05)。高氧+Gal-1組Nfr2蛋白的表達水平顯著高于高氧組(P<0.05)；而在AMPK抑制劑Compound C(Com C)存在的情況下，高氧+Gal-1+Com C組Nfr2蛋白的表達水平顯著低于高氧+Gal-1組(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05

注：與對照組比較，*P<0.05；與高氧組比較，#P<0.05；與高氧+Gal-1組比較，△P<0.05

3 討 論

ALI及其嚴重形式ARDS均為臨床常見危重疾病，患者肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞受損，導致彌漫性肺間質及肺泡水腫，表現為低氧合、低肺順應性、高生理死腔和通氣/血流比失調等的病理生理特征[9]，患者住院時間長、病死率高。半乳糖凝集素在機體的先天性和適應性免疫應答中均起到關鍵作用[10]。Correa等[11]研究表明，外源性Gal-1可通過抑制硝基酪氨酸的表達來減輕腎臟的氧化應激，從而減弱由缺血再灌注導致的腎臟損傷。Abebayehu等[12]研究顯示，Gal-1可通過促使巨噬細胞向M2表型分化，從而對抗ALI的發生與發展。本研究中，Gal-1預處理的大鼠肺部組織結構與高氧組相比較為規則完整，纖維滲出或炎性細胞浸潤均較少，肺泡損傷程度更輕；同時，高氧+Gal-1組大鼠肺泡W/D值顯著低于高氧組，表明Gal-1可有效改善高氧誘導的ALI。

炎癥反應和氧化應激在ALI的發生與發展中起重要作用。高氧暴露下機體產生大量 ROS，后者具有高度氧化活性，可氧化酶、核酸、結構蛋白等，從而導致肺泡毛細血管膜的破壞和上皮細胞的死亡，進而造成肺泡水腫和血氧交換受阻[13]。SOD對于防止氧化應激至關重要，其可通過抗氧化和抗自由基的功能有效抵御氧自由基對機體的損傷[14]。MDA在機體內的表達水平可體現體內氧自由基的水平，進而反映機體氧化應激的損傷程度[15]。本研究中，經Gal-1預處理的高氧+Gal-1組大鼠BALF中的TNF-α、IL-1β、IL-6、ROS和MDA的表達水平顯著低于高氧組，SOD的表達水平顯著高于高氧組，提示Gal-1可減輕高氧誘導的炎癥反應和氧化應激，從而起到改善ALI的作用。

Nrf2是廣泛存在于動物體內的防御氧化應激的關鍵轉錄因子，可與抗氧化反應元件(ARE)相結合而啟動器下游抗氧化基因，如HO-1和NQO-1等，從而抵御各種原因導致的細胞內氧化應激狀態[16]。Lei等[17]和Chen等[18]研究均顯示，增強Nrf2的活化可有效減輕小鼠ALI的損傷程度。本研究中，Gal-1預處理有效增強了ALI大鼠Nrf2表達，并同時顯著提高了Nrf2下游基因HO-1和NQO-1表達，提示Gal-1可通過Nfr2通路改善ALI大鼠的氧化應激狀態。

AMPK是由三條肽鏈組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，是人體能量代謝的重要調控劑，與促進分解代謝、抑制合成代謝、改善內皮功能、減輕炎癥反應和抑制氧化還原反應等多項功能密切相關[19]。已有研究[20]表明，AMPK可通過磷酸化等方式激活Nrf2，使其活化并生成下游抗氧化基因如HO-1、NQO-1等，以發揮抗氧化應激的作用。本研究結果顯示，高氧+Gal-1組pAMPK/AMPK高于對照組和高氧組，提示Gal-1預處理可顯著增加肺組織中AMPK的磷酸化；而采用AMPK抑制劑Com C預處理后發現，高氧+Gal-1+Com C組大鼠Nrf2蛋白的表達水平顯著低于高氧+Gal-1組，證實了AMPK與Nrf2之間的關聯。

綜上所述，Gal-1可通過激活AMPK磷酸化增強Nfr2通路，抑制炎癥反應和減少氧化應激，從而改善高氧誘導的ALI。Gal-1可能成為治療ALI的候選藥物。