恒古骨傷愈合劑對人骨髓間充質干細胞生長、分化的影響及機制研究

張 瑞，柳圍堤，程自超，杜懷峰

(西安交通大學醫學院附屬3201醫院康復醫學科，陜西 漢中 723000)

成骨細胞介導骨形成，破骨細胞介導骨吸收，兩者平衡在維持正常骨代謝過程中具有關鍵作用，調控該平衡對防治骨質疏松有積極意義[1]。骨髓間充質干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs)系存在于骨髓基質的非造血細胞來源細胞亞群，骨髓液含量最多，近年來其誘導成骨分化的作用日益引起骨科研究者的重視[2]。研究[3]發現，轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)信號通路在BMSCs成骨分化中有重要作用，間充質干細胞TGF-β1信號通路可促成其增殖及成骨分化，成骨細胞TGF-β1信號則可調控成骨晚期分化，參與鈣鹽沉積及膠原分泌過程。Smad蛋白為TGF-β受體作用信號傳導的中介分子，其中Smad2、Smad3可被TGF-β1受體活化，通過磷酸化方式激活，與Smads4形成復合物，轉導骨形態發生蛋白與受體結合，協同影響成骨基因轉錄[4]。目前對中藥調控TGF-β1/Smads信號通路的研究相對少見。恒古骨傷愈合劑主要成分為三七、紅花、黃芪、人參等，早期民間常用于骨病、骨折治療[5-6]。有臨床報道[7-8]證實，恒古骨傷愈合劑對骨質疏松性骨折有肯定的效果，對改善骨質疏松模型動物骨微結構有重要意義。但對于恒古骨傷愈合劑是否存在促骨形成作用及其對TGF-β1/Smads信號的調節作用，目前尚未明確。因此，本研究應用全骨髓貼壁法分離及培養人骨髓間充質干細胞(Human bone mesenchymal stem cells，hBMSCs)，并以恒古骨傷愈合劑誘導hBMSCs，探討恒古骨傷愈合劑對TGF-β1/Smads信號通路成骨細胞分化的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源 hBMSCs均取自健康成年志愿者。

1.2 主要試劑 恒古骨傷愈合劑(批號：Z20025103；云南克雷斯制藥股份有限公司)，胎牛血清(批號：11011-8611；北京索萊寶科技有限公司)，F12和DEME培養基(美國Gibco公司)，四氮唑鹽比色(MTT)試劑盒和胰蛋白酶(美國Bid-Rad公司)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號：12104A46；美國Thermo Fisher公司)，TRIzol試劑盒(美國Invitrogen公司)，RNA抽提試劑盒和DNA反轉錄試劑盒(美國Sigma公司)，SYBR Green super Mix(大連寶生生物科技有限公司)，定量PCR試劑盒和引物設計及合成(日本TaKaRa公司)，堿性磷酸酶(ALP)試劑盒(美國Invitrogen公司)，ALP染液(上海碧云天生物科技有限公司)，鼠單克隆Smad2/3/4抗體(一抗)(批號：AG07244496；美國Abcam公司)，辣根標記羊抗小鼠IgG(二抗)(批號：No.BSTiZH24C54；美國Proteintech公司)。

1.3 主要儀器 CO2細胞培養箱(美國Thermo公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)，凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)，熒光定量PCR儀(美國Biometra公司)，DYY-2電泳儀(北京六一儀器廠)，ELX 800型酶標儀(美國Bid Tek公司)。

1.4 細胞培養 取健康志愿者捐獻骨髓，無菌條件下髂后上棘骨穿刺，抽取肝素化骨髓液2～5 ml，全骨髓貼壁法[9]培養hBMSCs，細胞生長融合至80%時按1∶2比例進行傳代，吸去培養液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，加入胰蛋白酶消化30 s，80%細胞變圓后輕拍培養瓶促使細胞脫壁，加F12完全培養基3 ml終止消化。細胞懸液轉移至離心管，1200 r/min離心5 min，棄上清，加3 ml F12培養基重選，按3×104個細胞/cm2接種于培養瓶內，加4 ml F12完全培養基培養。細胞均勻貼壁厚，取生長良好第3代細胞，按5×103個/孔接種于96孔板，加完全培養基200 μl/孔培養24 h。細胞充分貼壁后，PBS洗滌3次，分為對照組(含10%胎牛血清DMEM培養基)和研究組(恒古骨傷愈合劑誘導，1.0 mg/ml)。研究組24 h細胞周期同步后添加含1.0 mg/ml恒古骨傷愈合劑血清培養基培養，48 h后去培養基，加MTT工作液100 μl，37 ℃培養4 h后棄上清，加100 μl二甲基亞砜，震蕩10 min，分別于48、72、96 h應用酶標儀于490 nm處讀取吸光度(OD)值，重復3次取均值，繪制培養不同時間細胞增殖曲線。

1.5 ALP染色 取生長良好第3代hBMSCs，按5×104個/孔接種于96孔板，加1.5 ml完全培養基。細胞貼壁至80%后，對照組繼續完全培養基，研究組給予含恒古骨傷愈合劑血清培養基，均設5個復孔，1周后加ALP染液，37 ℃孵育0.5 h后棄染液，蒸餾水漂洗3次，干燥后封片，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.6 實時熒光定量PCR(RT-PCR)檢測目的基因相對表達量 兩組細胞培養1周后，參照RNA抽屜試劑盒使用說明提取總RNA。濃度及純度滿意后，1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，反轉錄合成cDNA，RT-PCR儀測定TGF-β1、ALP、人Ⅰ型膠原(Col Ⅰ)、骨鈣素(OCN)、核因子-κB活化因子受體配體(RANKL)、破骨細胞抑制因子(OPG)相對表達量。PCR反應體系：cDNA 1.0 μg+正反向引物各0.5 μg+雙蒸水10.5 μl+SYBR Green 12.5 μl，引物序列見表1。PCR擴增條件：95 ℃預變性180 s，95 ℃變性30 s，60 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共30個循環后，72 ℃延伸10 min，以GAPDH為內參。循環反應完畢后PCR產物于2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，凝膠成像系統成像。以2-△△CT法計算各目的基因相對表達量。

表1 各基因引物序列

1.7 Western blot測定p-smad2/3蛋白表達 兩組細胞融合至80%時，細胞裂解液裂解提取總蛋白，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離等量蛋白質，每孔30～50 μg，轉移至聚偏二氟乙烯膜，PBS沖洗3次，加一抗孵育，4 ℃過夜。洗膜3次，加二抗(1∶5000稀釋)孵育1 h。洗膜3次，化學發光法顯色，以β-actin為內參，檢測p-Samd2/3蛋白水平，采用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以靶條帶灰度值與內參灰度值比值作為目的蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 兩組hBMSCs培養48 h細胞形態比較 見圖1。生長狀態良好第3代hBMSCs輪廓清晰，細胞大小均勻，呈長梭形，聚集化生長，細胞間隙增大，呈旋渦或平行排列。恒古骨傷愈合劑培養48 h后細胞形態逐漸變為圓形、多邊形，細胞界限模糊，呈現聚集特點，類似成骨細胞形態，見數量不均微小顆粒物質，部分見發育成熟礦化物。對照組培養48 h后細胞形態呈梭形，突起變長，分散生長，細胞兩極朝向不規律，可見少量微小顆粒物質。

圖1 研究組(左)與對照組(右)hBMSCs

2.2 兩組hBMSCs培養1周ALP染色結果比較 見圖2。研究組hBMSCs含藥血清培養1周后ALP染色程度高、顯色范圍廣，對照組ALP著色弱、強度低，表明研究組hBMSCs分化潛能高。

圖2 研究組(左)與對照組(右)hBMSCs

2.3 兩組hBMSCs培養不同時間細胞增殖活性比較 見表2。研究組hBMSCs培養不同時間增殖活性均高于對照組(F組間=9.785，F時間=14.265，F交互=12.175，均P<0.05)。

表2 兩組hBMSCs培養不同時間細胞增殖活性比較(%)

2.4 兩組hBMSCs培養1周各目的基因mRNA相對表達量比較 見表3。研究組hBMSCs培養1周TGF-β1、Col Ⅰ、OCN、OPG mRNA相對表達量高于對照組，RANKL mRNA相對表達量低于對照組(均P<0.05)。

2.5 兩組hBMSCs培養1周p-Smad2/3蛋白相對表達量比較 見圖3。研究組hBMSCs培養1周后p-Smad2/3蛋白相對表達量為0.465±0.125，對照組為0.147±0.019，研究組高于對照組(t=5.623，P<0.001)。

表3 兩組hBMSCs培養1周各目的基因mRNA相對表達量比較

注：左圖為p-Smad2/3蛋白電泳圖；右圖中，與對照組比較，*P<0.05

3 討 論

調查[10-11]顯示，我國有超過90%人群無法從日常飲食中攝取足夠的鈣，骨質疏松已成為威脅公眾健康的重要問題。骨質疏松屬退行性老年疾病，表現為骨量減少、骨微結構破壞，其發病主要與破骨細胞活性上升、骨吸收增多、成骨分化減少有關，導致成骨細胞功能衰竭、骨形成減少，造成骨代謝負平衡，故理想的治療骨質疏松藥物需圍繞促骨形成展開，輔以抑制骨吸收。目前多應用雙磷酸鹽類、雌激素類藥物等拮抗骨質疏松，它們均為抑制骨吸收類藥物，可控制骨吸收，但無明顯促骨形成效應，長期應用可能增加頜骨壞死、乳腺癌等發病風險[12]。重組人甲狀腺激素具有促骨形成作用，但可能誘發骨肉瘤發生[13]。中醫藥以補腎、壯骨及含黃酮類藥物為主，分子生物研究[14]發現中醫藥可通過多信號通路調控骨吸收、骨形成平衡，進而防治骨質疏松。李建國等[15]研究發現，淫羊藿提取物及其總黃酮可促進BMSCs成骨分化，上調Col Ⅰ、TGF-β1等成骨細胞特異性分子表達。李三華等[16]應用杜仲醇提取物誘導BMSCs，發現其可上調成骨分化因子表達。以上均顯示中醫藥在防治骨質疏松方面有較好的前景。

已有文獻[17]報道，恒古骨傷愈合劑可促進成骨細胞成熟及增殖。動物實驗[18]證實，恒古骨傷愈合劑可促進壞死股骨頭內源性骨形成蛋白表達。本研究發現，研究組hBMSCs培養1周后分化潛能較對照組高，ALP染色增強，細胞增殖活性隨培養時間延長而上升，推測恒古骨傷愈合劑可能存在促骨形成效應。ALP系成骨成熟的關鍵標志酶，其活性上升提示成骨分化及成熟[19]，而恒古骨傷愈合劑培養后ALP染色增強，推測恒古骨傷愈合劑可誘導ALP表達，促進成骨細胞增殖。目前臨床公認hBMSCs具多向分化潛能，如何誘導其定向分化為成骨細胞在骨質疏松及骨組織重建中有重要意義。我們發現恒古骨傷愈合劑可誘導其分化，進一步觀察其機制發現，hBMSCs含恒古骨傷愈合劑血清培養基培養1周后，成骨特異性標志物TGF-β1、Col Ⅰ、OCN mRNA相對表達量高于對照組，破骨細胞抑制因子OPG mRNA相對表達量高于對照組，破骨分化特異性標志物RANKL mRNA相對表達量低于對照組，提示恒古骨傷愈合劑可能存在促進骨形成及抑制骨吸收雙重效應。TGF-β系調控細胞生長、分化及細胞外基質合成的關鍵細胞因子，其中TGF-β1已被證實與骨折、骨質疏松及動脈粥樣硬化發生緊密相關[19-20]。但早期TGF-β生物學功能多集中于組織修復、炎癥及胚胎發育等方面[21-22]。近年來發現，TGF-β對細胞生長、分化起到不同程度的調節作用[23-24]。實驗研究發現，TGF-β對間充質起源細胞有明顯刺激效應。骨組織細胞分泌大量TGF-β1，與跨膜受體結合形成受體多元體啟動細胞信號轉導，刺激BMSCs增殖，促使其向成骨分化，實現骨形成及重建。早期TGF-β1已廣泛應用于骨折修復及骨質疏松治療效果評估中[25]。OCN系成骨細胞分泌的特異性蛋白，直接反映骨形成及骨轉化水平，成骨分化早期以ALP表達為主，成骨細胞成熟后期骨橋蛋白出現，分化為骨細胞，在礦化階段骨橋蛋白及OCN表達增加。本研究發現，恒古骨傷愈合劑可促進成骨特異性分子TGF-β1、OCN、Col Ⅰ mRNA表達，提示其有促骨形成作用，考慮恒古骨傷愈合劑可調控TGF-β1/Smads信號通路，激活成骨特異性因子表達，抑制破骨細胞特異性分子表達，進而發揮促骨形成作用。RANKL為破骨細胞形成的關鍵因子，可促進干細胞成破骨分化，通過調控RANKL表達可抑制骨吸收[26]。我們發現恒古骨傷愈合劑可抑制破骨相關抑制RANKL表達，推測其可能存在抑制骨吸收效應。

Smad家族為TGF-β關鍵受體，系TGF-β信號轉導重要細胞內介質，Smad2、Smad3通過C端受體介導磷酸化反應后激活，與Smad4形成復合物，轉移至細胞核，與其他轉錄因子協同調節特異性基因轉錄過程。TGF-β激活Smads后細胞生長停滯，間充質上皮細胞發生遷移。代光明等[27]研究發現，抑制TGF-β1/Smads通路可抑制成骨分化相關基因表達，阻礙成骨細胞增殖及礦化。在TGF-β1/Smads通路中，Smad2/3參與TGF-β1信號轉導，通過調控下游靶基因發揮促骨形成作用。我們發現，細胞培養1周后，研究組Smad2/3蛋白表達高于對照組，提示恒古骨傷愈合劑可促進Smad2/3蛋白表達，考慮恒古骨傷愈合劑可通過刺激TGF-β1分泌激活Smad2/3表達，發揮促骨形成作用。

綜上所述，恒古骨傷愈合劑很可能是通過上調TGF-β1/Smads通路成骨細胞特異性分子基因表達促進骨形成，同時存在抑制骨吸收效應，有望作為骨質疏松治療的新靶點，但對其具體生物學效應尚待進一步臨床試驗證實。