銀環蛇傷中毒巴馬小香豬模型構建與評估

李亞蘭，黃 智，何冬凌，程曉陽，莫財鋒，宋天麟，廖 明

(廣西醫科大學生命科學研究院，廣西 南寧 530021)

毒蛇咬傷中毒是發展中國家的一個主要公共衛生問題，全世界每年有180萬～270萬人被蛇咬傷，至少造成10萬人死亡，40萬人致殘。在我國每年有3萬～40萬人被蛇咬傷，病死率達5%～10%[1-3]。銀環蛇是我國十大毒蛇之一，毒性極強，咬傷中毒致死率居蛇傷首位，病死率為7%～50%[4-6]，如果不及時提供抗蛇毒血清治療，咬傷后6～30 h即死亡。銀環蛇咬傷中毒后，雖局部癥狀輕微，但由于銀環蛇毒主要是神經毒素，如果搶救不及時，病情將迅速惡化，一旦出現呼吸停止，容易造成患者死亡，是急診科一種常見危急重癥[7-9]。目前，對于銀環蛇咬傷的研究大多是回顧性的臨床急救與護理，對于深入的毒性機制、代謝變化研究較少，特別是缺乏精準的動物模型以支持更深入的基礎研究，因此亟待構建一種成熟穩定的銀環蛇傷中毒動物模型。巴馬小香豬作為我國特有大型哺乳實驗動物資源，具有遺傳穩定、解剖結構與人類非常類似的優勢，近年來被廣泛應用于器官移植等實驗外科研究[10-11]，然而迄今為止還未見銀環蛇傷中毒巴馬小香豬模型的構建。本研究首次以巴馬小香豬構建銀環蛇咬傷中毒動物模型；為最大限度地貼合臨床實際，采用了肌內注射銀環蛇毒方式；通過分析巴馬小香豬生物學行為狀態、血常規及血生化指標、組織病理學變化來評估模型的穩定性，以期為銀環蛇咬傷中毒基礎研究及臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 KM種小鼠50只，體重18～22 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK桂2014-0003。健康巴馬小香豬24只，體重10 kg左右，由廣西大學動物科學院提供，許可證號：SCXK桂2018-0003。所有動物飼養于SPF級環境，室溫20～22 ℃，濕度40%～70%，光照12 h明暗交替。本研究根據廣西醫科大學動物倫理學委員會指導，按照《實驗動物管理條例》對動物進行操作。

1.2 主要試劑及耗材 銀環蛇毒凍干粉(由廣西醫科大學蛇毒研究所提供)，0.9%氯化鈉注射液(山東省辰欣藥業股份有限公司)，5 ml注射器[北侖河(上海)醫療技術有限公司]，一次性真空采血管(平安醫療器械)。

1.3 實驗方法

1.3.1 銀環蛇毒對巴馬小香豬理論半數致死量(LD50)探索：依據文獻[12-14]，銀環蛇傷小鼠LD100和LD0為肌內注射劑量范圍。通過隨機數字表法將50只小鼠分為五組，分別為0.1 mg/kg組、0.075 mg/kg組、0.056 mg/kg組、0.042 mg/kg組、0.032 mg/kg組，每組10只，注射相應劑量后連續觀察7 d，記錄小鼠呼吸暫停時間及生存率。采用概率單位法(Bliss法)計算銀環蛇毒對小鼠的LD50，按照體表面積比率換算等效劑量法得出銀環蛇毒對巴馬小香豬的理論LD50

1.3.2 銀環蛇毒對巴馬小香豬理論LD50驗證：根據1.3.1得出銀環蛇毒對巴馬小香豬的理論LD50后，將18只健康巴馬小香豬隨機分為對照組(0.9%氯化鈉注射液)、0.12 mg/kg組、0.09 mg/kg組、0.06 mg/kg組、0.03 mg/kg組、0.01 mg/kg組，注射相應劑量后連續觀察7 d，記錄巴馬小香豬呼吸暫停時間及生存率。

1.3.3 銀環蛇傷中毒巴馬小香豬模型構建與評估：選取健康巴馬小香豬6只，隨機分為對照組及模型組，每組3只。對照組肌內注射0.9%氯化鈉注射液，模型組根據1.3.2結果肌內注射0.03 mg/kg銀環蛇毒建立銀環蛇傷中毒巴馬小香豬模型。通過行為學觀察、血液學指標檢測和組織病理學研究對模型進行評估。

1.3.3.1 行為學觀察：建模后，時刻觀察巴馬小香豬的生物學行為狀態，如精神狀態，對刺激的反應，有無呼吸困難、眼瞼下垂，是否出現四肢癱軟、口腔分泌物增多等情況。

1.3.3.2 血液學指標檢測：分別于注射蛇毒前以及注射蛇毒后3、12、24 h取小香豬前腔靜脈血用于檢測超敏C反應蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶(CK)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、肌酐(Cr)、碳酸氫根(HCO3-)、鉀離子(K+)、白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)等指標。

1.3.3.3 組織病理學研究：于實驗72 h后處死巴馬小香豬，采集心、肺、肝、腎及腦組織標本，放入10%福爾馬林內固定。固定的標本經充分水洗、酒精脫水和二甲苯透明后，用石蠟包埋，連續切片，切片厚度5 μm，經HE染色后做病理組織形態學檢查。

2 結 果

2.1 銀環蛇毒對巴馬小香豬的理論LD50根據各劑量組小鼠7 d內死亡情況(表1)，采用Bliss法計算出銀環蛇毒對小鼠肌內注射的LD50為0.049 mg/kg，95%置信區間為0.03795～0.060012 mg/kg。根據人與動物間體表面積折算的等效劑量比值推算，得出銀環蛇毒對巴馬小香豬的理論LD50為0.094 mg/kg。

2.2 銀環蛇毒對巴馬小香豬理論LD50的驗證 注射劑量為0.12 mg/kg時，巴馬小香豬7 d內病死率為100%；注射劑量為0.06、0.09 mg/kg時，巴馬小香豬病死率為66.67%；注射劑量為0.03 mg/kg時，巴馬小香豬病死率為33.33%；注射劑量為0.01 mg/kg時，巴馬小香豬均未出現死亡。從巴馬小香豬肌內注射銀環蛇毒劑量對應的病死率來看，由小鼠推斷出的銀環蛇毒對巴馬小香豬的理論LD50可信度較高。同時，參照常規毒理學造模方法、參照銀環蛇傷中毒臨床病死率7%～50%，以8/25 LD50=0.03 mg/kg作為銀環蛇傷中毒巴馬小香豬造模劑量。

2.3 兩組巴馬小香豬行為學變化 與對照組相比，模型組巴馬小香豬在注射蛇毒后2 h局部傷口癥狀表現不明顯，但出現嗜睡、運動失調、站立不穩、呼吸加快、口腔分泌物增多、垂涎等全身中毒癥狀；3 h后出現刺激反應減弱、眼瞼下垂、呼吸進一步加重、四肢癱軟；隨著中毒時間的推移，12 h后刺激反應極弱、呼吸由快變慢淺、呼吸無力、出現呼吸鳴音、臥地不起。

表1 各組小鼠肌內注射銀環蛇毒7 d內死亡情況[只(%)]

2.4 兩組巴馬小香豬血液學指標比較 見表2。與對照組相比，模型組注射蛇毒后3 h后，WBC、K+顯著降低，ALT、Cr、CK及HCO3-顯著增加(均P<0.05)；注射蛇毒12 h后，RBC顯著增加(P<0.05)；hs-CRP則在注射蛇毒3～24 h內維持升高狀態(均P<0.05)。

表2 兩組巴馬小香豬血液學指標比較

2.5 兩組巴馬小香豬心肌、肺、腦、肝及腎組織HE染色結果比較 見圖1。對照組心肌纖維排列尚整齊，肌纖維無腫脹，細胞核形態、大小均勻；肺泡結構完整，肺泡間隔未見增寬，無炎性細胞浸潤；腦組織神經元細胞及星型膠質細胞形態、大小均一正常，核染色質均勻，無明顯核周空暈。模型組心肌纖維腫脹，細胞核形態、大小不均勻，可見點狀壞死、心肌間質炎性細胞浸潤；肺泡結構可見塌陷，肺泡間隔明顯增寬，肺泡上皮細胞腫脹，出現濁腫和脂肪變性；腦組織神經元細胞可見急性腫脹、尼氏小體溶解，細胞空泡變形壞死。對照組及模型組巴馬小香豬肝腎組織未見明顯異常，肝小葉結構清晰完整，肝細胞胞質豐富，肝細胞索排列致密整齊；腎小球無皺縮，腎小囊腔無擴張，腎間質無水腫，間質內無炎性細胞浸潤。

3 討 論

銀環蛇屬前溝牙毒蛇，毒性劇烈，其蛇毒主要含有α-毒素(α-BTX)、β-毒素(β-BTX)及各種酶等成分。該蛇毒屬神經毒素，是一種小分子蛋白質或多肽類，可阻斷運動-肌肉接頭傳導，導致全身肌麻痹、呼吸衰竭[8]。銀環蛇傷患者局部傷口無紅腫、出血、壞死，但在傷后1～4 h逐漸出現全身性中毒癥狀，腱反射消失，呼吸困難，尿潴留，嚴重時出現多系統臟器衰竭，導致呼吸停止[15-16]。根據流行病學調查，在我國銀環蛇咬傷占各類毒蛇咬傷的8.2%，居第五位，而死亡人數卻居蛇傷首位，尤以華南和華東南部銀環蛇咬傷的病死率最高[17-19]。目前，對于銀環蛇毒這種急性毒，國內外大多以小鼠、大鼠及兔進行建模來探究銀環蛇傷機制，然而小型動物模型具有病程短、不穩定、難以長時間動態分析中毒機制等不足。巴馬小香豬作為優良的地方豬種，具有體型小、遺傳穩定、性情溫和、耐飼養、生理特點與人相似等優點，常作為病理和藥理實驗的良好載體[20-21]。

A-E：對照組；F-J；模型組。A、F：心肌組織；B、G：肺組織；C、H：腦組織；D、I：肝組織；E、J：腎組織

本研究利用巴馬小香豬構建銀環蛇傷中毒模型。同時，為判斷造模是否成功，進行了行為學觀察、血液學及組織病理學分析。巴馬小香豬肌內注射銀環蛇毒后，局部中毒癥狀不明顯，2 h內出現全身中毒癥狀，包括嗜睡、運動失調、站立不穩及口角流涎等現象，此癥狀是由于神經毒素中的α-BTX與終板區膽堿能受體結合，使乙酰膽堿不能作用于N2受體，從而產生了非去極化型神經-肌肉阻斷作用[22-23]；3 h后巴馬小香豬出現刺激反應減弱、四肢癱軟、呼吸無力等進一步的中毒癥狀。臨床上，銀環蛇傷患者早期常無明顯癥狀，一般在3～3.6 h出現首發癥狀，包括咽痛、上瞼下垂、全身肌痛、呼吸困難和吞咽困難，進一步發展將出現腱反射減弱、瞳孔散大、呼吸肌麻痹及四肢癱瘓[24-25]。可見，銀環蛇傷中毒巴馬小香豬模型基本符合銀環蛇神經毒素臨床中毒癥狀。

本研究發現，與對照組相比，注射蛇毒后3 h WBC顯著低于對照組，CK、hs-CRP則顯著高于對照組，12 h后RBC顯著升高，可能是由于銀環蛇毒進入血液循環造成中毒感染、呼吸衰竭、心肺組織病變等導致相關血液學指標反饋性異常。ALT、Cr、HCO3-于注射蛇毒后3 h顯著升高，K+顯著降低，AST未見明顯變化，提示蛇毒對于巴馬小香豬體內肝腎組織功能可能造成一定影響。病理學結果顯示，模型組心肌、肺及腦組織損傷明顯，心肌細胞明顯排列紊亂，細胞多渾濁腫脹，肺泡間隔明顯增寬，其間可見大量炎性細胞滲出，腦組織神經細胞發生腫脹，尼氏小體消失，核偏位。病理組織損傷結果印證了血液學相關指標的變化，與既往研究[7，26-27]結果相一致。

綜上所述，以0.03 mg/kg銀環蛇毒肌內注射，可以成功構建穩定性好、重復性高、符合臨床特點的銀環蛇咬傷中毒巴馬小香豬模型。