環介導恒溫擴增法在肺結核診斷中的應用

王 欣，虞典元，胡小平，黃 晶，張 虹

（1.湖北省孝感市中心醫院檢驗科，孝感432100；2.湖北省孝感市中心醫院腎內科，孝感432100；3.江蘇省蘇州高新區人民醫院檢驗科，蘇州215129）

結核病（tuberculosis，TB）是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的一種慢性傳染性疾病。2018年全球新增確診1 000萬病例，并造成120萬人死亡，我國每10萬人中有61例新病例[1-2]。如果及時進行治療，TB是可以治愈的，因此及時發現TB患者并進行治療是控制TB傳播的關鍵。TB的診斷包括臨床評估和病原學檢測[3]。痰涂片顯微鏡檢查便宜且易于操作，但其敏感度和特異度不佳[4]；結核桿菌培養法是目前診斷TB的參考標準，但耗時長[5]；分子診斷是一種新的檢測方法[3]，但有的操作繁雜，有的價格昂貴且需要較高的實驗室條件。因此，急需一種簡便、快速、價廉，且敏感度、特異度高的檢測方法，以早期發現TB患者，達到早日治療、控制傳染源的目的。環介導恒溫擴增技術（LAMP）檢測與培養法相比，實驗時間較短，并具有較好的敏感度與特異度，同時不需要專門的核酸擴增儀器和煩瑣的實驗步驟，也不需要頂尖的技術手法[6]。本研究采用痰涂片鏡檢法、改良羅氏培養法（L-J）、LAMP法同時對400例肺結核疑似患者的痰樣本進行檢測，以結核菌培養為標準，評價LAMP法對肺TB的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月孝感市中心醫院就診的400例肺結核可疑癥狀患者作為研究對象，所有患者均通過臨床癥狀和影像學檢測確定，并將痰標本送至孝感市中心醫院進行基因芯片檢測進行確診。臨床癥狀包括患者咳嗽兩周或更長時間并伴有一種或多種其他癥狀：體質量減輕、食欲不振、盜汗、胸痛、發燒、呼吸急促、疲勞等。根據肺結核診斷標準（WS288-2017）將研究對象分為肺TB組和非肺TB組。其中肺TB組272例，非肺TB組128例。男性246例，女性154例，年齡13～81歲，平均年齡（51.2±0.32）歲。

1.2 儀器與試劑

LAMP儀（廣州迪澳生物科技有限公司）。LAMP檢測試劑盒（廣州迪澳生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 痰結核分支桿菌涂片及鏡檢 痰標本采用直接涂片抗酸染色后進行顯微鏡檢查，具體參照《中國TB防治規劃·痰涂片鏡檢標準化操作及質量保證》[7]收集肺結核疑似患者的痰標本并進行涂片鏡檢。

1.3.2 L-JMTB培養 取痰標本2 mL溶于2～4 mL的4%氫氧化鈉（NaOH）中（根據痰標本的濃稠度，加入4% NaOH體積為痰液的1～2倍），進行震蕩搖勻消化15～20 min，使標本得到充分的液化；使用無菌吸管分別取標本沉淀2～3滴均勻接種于2管酸性培養基斜面的上、中、下部，將培養基管斜放入37℃培養箱中，于接種第3和第7天分別觀察1次，以后每周觀察1次，并記錄相關結果，直至第8周末。

1.3.3 LAMP法檢測MTB按照試劑盒說明書進行操作。同批次樣品檢測設置陰陽性對照及質控。樣品處理：取痰標本溶于同等體積的4%NaOH中，震蕩混勻后，室溫靜置15 min，取1 mL加入離心管中，12 000 r·min-1離心5 min后去上清；加1 mL 0.9% NaCl混勻，離心5 min后去上清；再加入100 μL DNA提取液混勻，100℃加熱10 min后迅速進行冷卻，離心2 min后取上清用于核酸檢測。核酸擴增：于PCR反應管中加入密封液，并將2 μL模板加入到密封液液面下，瞬時離心后放入LAMP儀中，63℃擴增45 min。結果判定：擴增曲線呈S型，則為陽性，即檢出MTB復合群；若擴增曲線呈直線或其他，則為陰性，未檢出MTB復合群或低于檢測限（1×102/mL）。

1.4 觀察指標

觀察LAMP法檢測診斷肺結核的敏感度、特異度和準確率。采用Kappa檢測法對LAMP檢測與痰涂片鏡檢和痰液培養檢查結果之間的一致性進行分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，以結核菌培養法為標準，計算LAMP檢測的陽性數及陽性檢出率。配對設計資料的χ2檢驗比較LAMP與抗酸桿菌涂片及MTB培養在檢出率上的差異，各檢測方法與臨床診斷結果一致性采用Kappa檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般特征

本研究共納入400例肺結核疑似患者。在開始抗結核治療之前，收集所有患者的痰樣品。在TB可疑患者中，最常見的臨床表現是盜汗375例（93.75%），肺浸潤279例（69.75%）和體質量減輕226例（56.5%）。

2.2 三種方法對MTB的陽性檢出率比較

在400例研究對象中，LAMP法的陽性檢出率［51.75%（207/400）］高于痰涂片鏡檢法［31.75%（127/400）］和固體培養法［40.25%（161/400）］（χ2=32.89，P＜0.001；χ2=10.65，P=0.001）。

2.3 三種方法的檢測效能評價

以臨床診斷和基因芯片結果為標準，LAMP法的敏感度（74.26%）高于痰涂片鏡檢法（46.69%）和L-J培養法（59.19%）（χ2=43.26，P＜0.001；χ2=8.88，P=0.003），見表1。

表1 三種方法檢測MTB的效能比較

2.4 L-J培養法和LAMP法在痰涂片鏡檢陰性患者中檢測MTB的效能比較

在273例痰涂片鏡檢陰性患者中，L-J培養法和LAMP法的陽性檢出率分別為16.11%（44/273）、30.03%（82/273），LAMP法高于L-J培養法（χ2=43.31，P＜0.001）。以臨床診斷結果為標準，LAMP法的敏感度為56.55%（82/145），L-J培養法的敏感度為30.34%（44/145），LAMP法敏感度高于L-J培養法（χ2=86.78，P＜0.001），見表2。

表2 L-J培養法和LAMP法在痰涂片陰性患者中檢測MTB的效能比較

2.5 LAMP法在痰涂片鏡檢及L-J培養陰性患者中檢測MTB的效能評價

在229例痰涂片鏡檢及L-J培養陰性患者中，LAMP的陽性檢出率為19.65%（45/229）。以臨床診斷結果為標準，LAMP法檢測MTB的敏感度和特異度分別為44.55%（45/101）、96.09%（123/128），見表3。

表3 LAMP法在痰涂片鏡檢及L-J培養陰性患者中檢測MTB的效能

3 討論

快速及時診斷TB，對有效治療疾病和預防感染擴散至關重要。目前，TB的診斷主要依賴于痰涂片抗酸染色鏡檢及結核桿菌固體培養[8]，由于敏感度較低、檢測周期長等缺點，不利于治療方案的制定和實施，涂片陰性者在等待報道期間，臨床醫師僅能經驗性用藥，進而可能延誤最佳治療時機，不利于預后康復[9-10]。快速分子診斷方法可以顯著地篩查漏診病例從而達到及早治療和控制感染的目的[11]。但是，當前分子診斷方法的實用性受到其成本和操作復雜性的限制。LAMP法是一種快速檢測MTB的分子診斷技術，不需要專有設備，可迅速檢測標本中是否存在MTB[12-13]。

本研究將臨床診斷結果作為參考方法，將LAMP法與痰涂片鏡檢法及L-J培養法進行了比較。發現LAMP法對肺結核患者痰標本的陽性檢出率、敏感度及特異度均高于痰涂片鏡檢法和L-J培養法。LAMP診斷肺結核的敏感度為74.26%，特異度為96.09%，高于痰涂片鏡檢法和L-J培養法，與Gelaw等[5]報道的結果相當（敏感度75%，特異度98%），提示LAMP法的臨床應用價值高于痰涂片鏡檢法和L-J培養法。與Bojang等[14]報道的LAMP法特異度（94%）相比，本研究的LAMP分析的特異度（96.09%）更高，但其發現LAMP法具有更高的敏感度（99%）。

在痰涂片鏡檢陰性患者中，LAMP法檢測的敏感度為56.55%，高于L-J培養法30.34%，LAMP法檢測結果與臨床診斷結果具有中度一致性（Kappa=0.51）；在痰涂片鏡檢和L-J培養陰性患者中，LAMP法檢測MTB的敏感度為44.55%，與臨床診斷結果相比具有中等一致性（Kappa=0.43）。LAMP法在痰涂片鏡檢陰性患者中的陽性檢出率為30.03%，在痰涂片鏡檢和L-J培養結果均陰性的患者中的陽性檢出率為19.65%，孫嬌等[15]發現在痰涂片鏡檢和L-J培養均陰性標本中，LAMP法的陽性檢出率為20%～30%，本研究的結果與其相一致。提示LAMP法對于檢測痰涂片鏡檢和L-J培養陰性肺結核患者具有一定的優勢。

本研究中LAMP法與L-J培養結果存在不一致的情況：L-J培養未檢出而LAMP檢出有53例，原因可能是L-J培養法需對痰標本進行消化等前處理工作，若消化液使用過多或消化時間過長，可能會使MTB失活甚至死亡，從而無法培養出陽性菌落；另外LAMP法檢測的是MTB的核酸，無論細菌是否有活性，均可被檢出，而L-J培養法只可以檢測出活的MTB[16]。LAMP檢測陰性而L-J培養檢測陽性7例可能原因分析如下：LAMP的取樣量少，為60 μL，取樣部位及取樣量均可影響檢測結果[17]。

綜上所述，LAMP法對肺結核患者痰標本的陽性檢出率及敏感度及特異度均高于痰涂片鏡檢法和L-J培養法，LAMP在結核感染及涂陰肺結核中均具有較高的診斷效能，對臨床結核感染早期快速診斷尤其是涂片檢查陰性者有較高的應用價值，且具有耗時短、操作簡單、檢測成本低的特點，值得臨床推廣和借鑒。