AMPK、YAP1與E-cadherin蛋白在胃癌組織中的表達及臨床意義

王詩妍，林 晚，張飛雄

（1.寧夏醫科大學，銀川750004；2.寧夏體檢康復保健中心，銀川750011；3.寧夏醫科大學總醫院，銀川750004）

胃癌是人類最常見的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內有很高的發病率和病死率。因此，探討胃癌的發病機制和預防手段、尋找胃癌治療的靶點具有十分重要的意義。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）是一種獨特的能量感受器，與腫瘤的發病密切相關。研究[1]證實，AMPK在人類多種實體腫瘤的增殖、凋亡、胃癌上皮-間質轉化（EMT）過程以及侵襲轉移中均發揮重要作用。本課題組前期的研究發現，激活AMPK抑制EMT和侵襲轉移能力，其作用機制可能為調控Yes相關蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）亞細胞定位和磷酸化水平。YAP1是Hippo通路下游的轉錄共激活因子[2]，發揮中心效應作用[3]，參與生長、發育及DNA修復等過程，在乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌[4-6]等多種惡性腫瘤中過表達，是一種致癌基因，促進口腔癌、胰腺癌、肺癌等多種癌細胞的增殖、EMT表型和侵襲轉移[7-9]。研究[10-11]報道，YAP1與胃癌EMT有極為密切的關系。Ecadherin是鈣黏蛋白家族成員之一，主要參與細胞間連接，是EMT過程中的重要標記物，其表達異常與腫瘤的發生、發展密切相關，可以抑制腫瘤細胞的遷徙和轉移[12]。本研究應用免疫組化方法檢測胃癌組織中AMPK、YAP1、E-cadherin的表達，分析各基因與胃癌臨床病理特征的關系，并分析AMPK、YAP1、E-cadherin蛋白之間的相互作用關系，探討AMPK在胃癌發生、發展中的作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年1月至2020年1月在寧夏醫科大學總醫院胃腸外科和寧夏醫科大學總醫院腫瘤醫院腫瘤外科行胃癌根治術患者的組織標本60例，其中男性35例，女性25例；年齡32～79歲，平均年齡（55.42+15.86）歲；腫瘤＜5 cm 36例，腫瘤＞5 cm 24例；無脈管浸潤者29例，有脈管浸潤者31例；高分化腺癌28例，中低分化腺癌32例；無淋巴結轉移者25例，有淋巴結轉移者35例；Ⅰ～Ⅱ期患者27例，Ⅲ～Ⅳ期患者33例。所有患者均為首次行胃鏡檢查及病理活檢確診的胃癌患者，未進行放療、化療及靶向藥物等治療，臨床病理資料（包括患者的性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化程度、脈管浸潤、淋巴結轉移、TNM分期）完整。本研究經寧夏醫科大學總醫院醫學倫理審查委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

AMPK、YAP1、E-cadherin抗體均購自美國Cell Signaling公司，SP免疫組化檢測試劑盒、DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化（SP法）1）脫蠟、水化：切片置于二甲苯中浸泡10 min；無水乙醇、95%乙醇、70%乙醇中各浸泡5 min；3%H2O2滴加在切片上，室溫靜置10 min；PBS洗2～3次各5 min。2）抗原修復：抗原修復溶液（pH 8.0）高壓修復3 min。3）過氧化氫15 min，滴加正常山羊血清封閉液20 min。滴加AMPK、YAP1、E-cadherin一抗50 μL，4℃過夜。次日滴加二抗50 μL，室溫靜置1 h；DAB顯色5～10 min，在顯微鏡下掌握染色程度；蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化；自來水沖洗10 min；脫水、透明、封片、鏡檢。

1.3.2 免疫組化結果判讀 按照雙盲法閱片判斷染色結果，由兩位病理科專家對免疫組化染色結果進行評估，隨機選取5個視野，根據染色強度及陽性細胞數量雙評分法進行評分[13]。首先按染色強度評分：不著色為0分，淡黃色或藍色為1分，棕黃色或紫藍色為2分，棕褐色或藍黑色為3分；再按陽性細胞所占的百分比評分：陽性細胞數＜10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。兩種評分相加所得的總分值即為最后的評分結果，0～4分為弱表達，6～9分為強表達。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0統計軟件，計數資料用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。AMPK、YAP1、E-cadherin之間的相關性分析采用Spearman等級相關分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AMPK、YAP1、E-cadherin在胃癌組織及其癌旁正常組織中的表達

AMPK、YAP1和E-cadherin在胃癌組織與癌旁正常組織中的染色如圖1所示，AMPK以細胞質、胞漿染色為主，YAP1以細胞核和細胞質、胞漿染色為主，E-cadherin以細胞膜染色為主。AMPK在胃癌組織中的表達陽性率為40.00%（24/60），低于癌旁正常組織的85.00%（51/60）（P＜0.05）；YAP1在胃癌組織中的表達陽性率為80.00%（48/60），高于癌旁正常組織中的28.33%（17/60）（P＜0.05）；E-cadherin在胃癌組織中的表達陽性率為36.67%（22/60），低于癌旁正常組織中的75.00%（45/60）（P＜0.05），見表1。

表1 AMPK、YAP1與E-cadherin在胃癌中的表達（例）

圖1 胃癌組織及其癌旁正常組織中AMPK、YAP1、E-cadherin的表達

2.2 胃癌組織中AMPK、YAP1、E-cadherin的表達與各臨床病理特征的關系

胃癌組織中，AMPK的表達與腫瘤分化程度、脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關（P均＜0.05），與患者的性別、年齡、腫瘤大小無關（P均＞0.05）；YAP1的表達與腫瘤大小、腫瘤分化程度、脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關（P均＜0.05），與患者的年齡、性別無關（P均＞0.05）；Ecadherin的表達與脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關（P均＜0.05），與患者的年齡、性別、腫瘤大小和腫瘤分化程度無關（P均＞0.05），見表2。

表2 AMPK、YAP1、E-cadherin與胃癌患者各臨床病理特征的關系（例）

2.3 胃癌組織中AMPK、YAP1、E-cadherin表達的相關性

AMPK與YAP1在胃癌組織中的表達呈負相關（rs=-0.446，P<0.01），與E-cadherin表達呈正相關（rs=0.586，P<0.01）。YAP1與E-cadherin在胃癌組織中的表達呈負相關（rs=-0.223，P＜0.01），見表3、表4。

表3 胃癌組織中AMPK與YAP1、E-cadherin表達的相關性（例）

表4 胃癌組織YAP1與E-cadherin表達的相關性（例）

3 討論

腫瘤細胞可以通過Warburg效應獲取能量，以克服因過度增殖導致的能量供應危機，Warburg效應中相關的一些酶的突變或丟失可促進EMT[14]，加快腫瘤惡性進程。而AMPK作為一種能量感受器在腫瘤的發生、發展過程中起重要作用，如臨床中常用的降糖藥二甲雙胍，已被證實通過激活AMPK，對胃癌、胰腺癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞產生抑制作用。

研究[15-16]顯示，AMPK通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、p53、MAPK、ERK、TGF-β等信號通路調控腫瘤細胞的自噬、凋亡、細胞周期和生長轉移能力。文獻[17]報道，AMPK信號通路與Hippo信號通路之間存在交叉對話，二者相互作用調控細胞的能量代謝和生長發育，在生理和病理過程中均有密切關系。Hippo信號通路在惡性腫瘤發病中主要發揮抑制性作用[18]，與其抑癌基因失活關系密切[19]。YAP1是Hippo信號通路下游的關鍵因子，被證實為原癌基因[20-21]。YAP1保護某些特異的氨基酸結構域，通過這些特異氨基酸結構域與一些蛋白質產生作用，參與多種信號通路[22]。Hippo信號通路失活，使得YAP1去磷酸化激活，從而導致一系列增殖和凋亡相關的基因表達失衡，細胞過度增殖，促進腫瘤發生、發展[23]。

本研究結果顯示，AMPK在胃癌組織中的表達低于癌旁正常組織，與之相反，YAP1在胃癌組織的表達明顯高于癌旁正常組織，二者呈負相關，并且AMPK、YAP1的表達均與腫瘤分化程度、脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關。有研究[24]報道，磷酸化AMPK的表達上調與胃癌進展相關，是原發性胃癌切除術后的獨立預測因子，YAP在原發性和轉移性胃癌患者中的表達高于正常人胃上皮增生區[25]。YAP/TAZ過表達與胃癌患者淋巴轉移及預后較差密切相關[26]。結合本研究結果提示AMPK和YAP1有望成為臨床中預測胃癌惡性程度的指標。EMT是惡性腫瘤的重要特征之一，是腫瘤細胞浸潤轉移的關鍵步驟，與胃癌的侵襲轉移密切相關。EMT過程中伴隨多個分子標記物的改變，E-cadherin表達的下調是EMT的最重要標志之一。前期的基礎實驗結果顯示，激活AMPK后，胃癌細胞中E-cadherin表達下調，而vimentin、α-SMA表達上調。在胃癌組織中，E-cadherin在胃癌中低表達，在癌旁正常組織中高表達，其表達與脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期有關，而與腫瘤大小、腫瘤分化程度無關，AMPK與E-cadherin表達呈正相關，而YAP1與E-cadherin表達呈負相關，提示AMPK、YAP1均參與胃癌EMT，結合前期細胞學研究，我們推測AMPK與Hippo-YAP1信號通路相互作用，共同影響胃癌EMT，調控胃癌浸潤轉移。

因此，AMPK、YAP1、E-cadherin在胃癌組織中表達異常，且與脈管浸潤、淋巴結轉移和TNM分期相關，在一定程度上可預測腫瘤的惡性程度和復發轉移發生率。臨床中聯合檢測可提前篩選出復發轉移的高危人群，術后適當輔助放化療并加強隨訪復查力度，對降低術后復發轉移有一定幫助。