氧化應(yīng)激對慢性阻塞性肺疾病上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

胡進(jìn)秀，崔節(jié)達(dá)，郭曉桐，郝斌威，陳 娟

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川750004；2.寧夏中衛(wèi)市人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，中衛(wèi)755000；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥學(xué)科，銀川750004；4.山西白求恩醫(yī)院，山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，太原030000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種不可逆的慢性炎癥性肺疾病[1]。研究[2]顯示，2015年COPD疾病導(dǎo)致320萬人死亡，患病人數(shù)達(dá)1.74億人次。我國40歲以上人群COPD患病率達(dá)13.6%[3]。因此研究COPD的發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要，探索早期干預(yù)和治療措施是COPD防控工作的重點(diǎn)，也是改善COPD患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

COPD的特征是慢性支氣管炎、慢性氣道阻塞、氣道重塑和肺氣腫所導(dǎo)致的肺功能逐漸且不可逆轉(zhuǎn)的下降[4]。氣道間充質(zhì)細(xì)胞（例如，成纖維細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞等）通過增殖，收縮蛋白表達(dá)和釋放介質(zhì)（例如，介體、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶）促進(jìn)氣道重塑[5]，表明氣道重塑過程中存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。隨著研究的深入，越來越多的證據(jù)表明EMT存在于許多疾病的發(fā)生過程中，并發(fā)揮重要作用[6]。

總抗氧化能力（total antioxidant capacity，TAOC）是抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)的重要構(gòu)成部分，也是評估生物有機(jī)體抗氧化系統(tǒng)能力的綜合參數(shù)[7]。COPD的主要驅(qū)動(dòng)機(jī)制是通過多種相互作用的分子機(jī)制，肺部氧化應(yīng)激增加實(shí)現(xiàn)的[8]。其中，F(xiàn)2異前列腺素家族被提議作為氧化應(yīng)激的新指標(biāo)[9]。其異構(gòu)體之一的8-異前列腺素F2α（8-Isoprostaglandin F2α，8-iso-PGF2α）也是評估氧化應(yīng)激的磷脂膜的重要生物標(biāo)記物[10]。氧化應(yīng)激作為COPD發(fā)病機(jī)制之一，也是引發(fā)氣道重塑的重要機(jī)制，在COPD發(fā)生、發(fā)展中有著極為重要的作用。有報(bào)道[6]指出，EMT與COPD疾病密切相關(guān)，證明氣道上皮細(xì)胞有可能發(fā)生EMT。EMT的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，本研究擬探討COPD是否存在EMT現(xiàn)象及COPD中EMT的發(fā)生與氧化應(yīng)激的可能關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

兔抗E-鈣粘連蛋白（E-cadherin，E-Ca）抗體（Abcam公司），兔抗纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）抗體（Abcam公司），山羊抗兔、兔辣根過氧化物酶抗體、血清封閉液、蘇木素、伊紅等免疫組化試劑均購自北京中杉金橋生物有限公司。組織總蛋白提取試劑盒及BCA法蛋白含量測定試劑盒（南京凱基生物公司）。

1.2 研究對象與分組

收集2015年1月至2017年12月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心胸外科因肺部腫瘤需行肺葉切除的患者，術(shù)前完善肺功能檢查，按照2017版慢性阻塞性肺疾病全球倡議（GOLD指南）分為肺功能正常（對照）組（20例）和肺功能異常（COPD）組（16例）。術(shù)前納入所有患者一般資料：性別、年齡、吸煙史、動(dòng)脈二氧化碳分壓（PCO2）、動(dòng)脈氧分壓（PO2）、第一秒用力呼氣量/用力肺活量（FEV1/FVC%）和一秒容積占預(yù)計(jì)值的百分比（FEV1 %pred）。術(shù)中獲取新鮮肺組織，進(jìn)行石蠟包埋及液氮凍存。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院科研倫理委員會批準(zhǔn)（2016-205），并獲得患者知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 HE染色觀察COPD肺組織氣道形態(tài)學(xué)改變 肺組織病理切片經(jīng)脫蠟、水化、蘇木素和伊紅染色、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)變化。

1.3.2 免疫組織化學(xué)檢測肺組織EMT標(biāo)記物E-Ca和FN的表達(dá) 肺組織病理切片經(jīng)脫蠟、水化、高壓修復(fù)6 min待修復(fù)液自然冷卻后，加3%H2O230 min，山羊血清封閉1 h，一抗4℃過夜孵育（1∶200稀釋E-Ca抗體，1∶250稀釋FN抗體）；次日37℃復(fù)溫1 h后，滴加二抗試劑1，37℃孵育40 min，滴加二抗試劑2，37℃孵育40 min，DAB顯色（顯微鏡下觀察）、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片、顯微鏡下采圖。陰性對照以磷酸鹽緩沖溶液（PBS）替代一抗。采用Image J軟件對病理切片進(jìn)行分析，得出每個(gè)視野氣道上皮細(xì)胞E-Ca及FN蛋白著色的平均光密度（average optical density，AOD）值。

1.3.3 蛋白免疫印跡法檢測肺組織中E-Ca和FN的表達(dá)情況 提取肺組織總蛋白后測定組織總蛋白含量，每孔蛋白上樣40 μg，通過8%聚丙烯酰胺凝膠（PAAG）轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1.5 h后，分別加入目的蛋白的抗體（兔抗人E-Ca抗體，稀釋濃度1∶1 000；兔抗人FN抗體，稀釋濃度1∶2 000）；4℃過夜，TBST洗4次每次8 min，人抗兔二抗（1∶5 000）孵育1.5 h，洗膜，免疫印跡曝光，使用軟件Image J對圖像進(jìn)行掃描和分析確定目標(biāo)蛋白與內(nèi)參的比值。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）法檢測血清中8-iso-PGF2α和T-AOC的濃度 收集COPD組及對照組患者術(shù)前靜脈血，1 500 r·min-1離心15 min，吸取血清進(jìn)行8-iso-PGF2α和T-AOC ELISA檢測，標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品每孔50 μL，立即加入100 μL 1×辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測抗體工作液。覆蓋遮光膜，在37℃溫箱孵育60 min，用力甩去孔中液體，加1×洗滌液350 μL/孔，浸泡1 min/次，甩去洗滌液。重復(fù)5次（洗板機(jī)操作）。同時(shí)分別加入50 μL 1×底物A工作液，1×底物B工作液，覆蓋遮光膜，放入37℃溫箱孵育20 min。加入終止液50 μL，立即用酶標(biāo)儀測量波長450 nm處光密度值。計(jì)算AOD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料進(jìn)行方差齊性檢測，用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 COPD組及對照組患者一般情況比較

COPD組及對照組在性別、年齡、吸煙史、PCO2及PO2方面差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），COPD組肺功能指標(biāo)FEV1/FVC%、FEV1%pred均低于對照組（P均＜0.05），見表1。

表1 COPD組及對照組患者一般情況比較（±s）

表1 COPD組及對照組患者一般情況比較（±s）

?

2.2 COPD組與對照組患者小氣道的病理形態(tài)學(xué)改變情況

HE染色結(jié)果顯示：與對照組相比，COPD組患者小氣道上皮細(xì)胞增生明顯，上皮細(xì)胞排列紊亂，小氣道平滑肌細(xì)胞增生，見圖1。

圖1 COPD組與對照組小氣道的病理形態(tài)學(xué)改變情況（HE×400）

2.3 COPD組與對照組患者肺組織中EMT標(biāo)記物E-Ca及FN的表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)結(jié)果示：E-Ca在氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)COPD組（0.142±0.068）低于對照組（0.256±0.067）（P=0.016），見圖2；FN在小氣道上皮細(xì)胞中的表達(dá)COPD組（0.156±0.043）高于對照組（0.072±0.058）（P=0.035），見圖3。免疫印跡檢測結(jié)果顯示：E-Ca蛋白表達(dá)量COPD組（0.36±0.20）低于對照組（0.84±0.46）（P=0.003），F(xiàn)N蛋白表達(dá)量COPD組（0.60±0.22）高于對照組（0.39±0.22）（P=0.026），見圖4。

圖2 肺組織氣道上皮中E-Ca的表達(dá)情況

圖3 肺組織氣道上皮中FN的表達(dá)情況

圖4 肺組織氣道上皮中E-Ca、FN蛋白表達(dá)情況

2.4 COPD組與對照組患者血清中8-iso-PGF2α和T-AOC水平比較

ELISA法檢測結(jié)果：COPD組血清8-iso-PGF2α濃度［（45.91±21.17）pg·mL-1］高于對照組［（29.74±15.88）pg·mL-1］（P=0.013）；而COPD組血清T-AOC濃度［（8.49±3.43）U·mL-1］低于對照組［（13.35±4.28）U·mL-1］（P=0.001）。

3 討論

COPD是嚴(yán)重危及人類生命健康的慢性疾病之一，其罹患率和病死率較高，COPD發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全探明。氣道重塑和氧化應(yīng)激在COPD發(fā)生、發(fā)展中的作用已達(dá)成共識，但潛在的機(jī)制仍不清楚[11]。有研究[12-13]表明，COPD患者氣道重塑有EMT出現(xiàn)，在COPD氣道重塑過程中，上皮細(xì)胞功能的異常可促使EMT的發(fā)生，是COPD氣道重塑的新發(fā)機(jī)制，但氧化應(yīng)激是否參與小氣道EMT在COPD中的作用目前研究較少。EMT失去上皮細(xì)胞等特性：緊密連接、纖毛和頂端基底極性，轉(zhuǎn)變成具有間質(zhì)細(xì)胞特性：遷移、侵襲和細(xì)胞外基質(zhì)[14]。EMT發(fā)生的標(biāo)志是上皮標(biāo)記物細(xì)胞黏附分子E-Ca的喪失，間質(zhì)標(biāo)記物FN等表達(dá)的增多，大量證據(jù)顯示EMT參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[6]，還和許多纖維化疾病有關(guān)（肺纖維化和眼纖維化），同時(shí)與乳腺癌、肺癌和胃癌等疾病也密切相關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，COPD患者肺組織存在小氣道上皮細(xì)胞增生和排列紊亂，氣道上皮細(xì)胞的形態(tài)及結(jié)構(gòu)較對照組發(fā)生明顯改變，表明COPD患者存在以上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能改變?yōu)橹鞯臍獾乐厮埽幻庖呋瘜W(xué)組織染色及免疫印跡檢測結(jié)果表明：COPD組中EMT間質(zhì)表型標(biāo)記物FN高表達(dá)、上皮表型標(biāo)記物E-Ca低表達(dá)，提示COPD患者小氣道上皮細(xì)胞存在明顯的EMT現(xiàn)象，EMT的發(fā)生、發(fā)展可能在COPD氣道重塑的病理機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。氧化應(yīng)激的產(chǎn)生是由于活性氧（ROS）的存在削弱了內(nèi)源性抗氧化劑防御能力和（或）使其不堪重負(fù)[16]。有研究[17]表明，氧化應(yīng)激可能推動(dòng)了COPD的發(fā)病機(jī)制及其進(jìn)展[18]。也有研究表明[19]，氧化應(yīng)激會引起小鼠氣道壁增厚和膠原蛋白沉積，隨后出現(xiàn)氣道重塑及肺氣腫的一系列病理改變。氧化應(yīng)激是COPD重要的發(fā)病機(jī)制，氧化應(yīng)激的增加是驅(qū)動(dòng)COPD生理、病理的主要機(jī)制，過多的自由基會損害脂肪組織和DNA，從而導(dǎo)致基因表達(dá)異常、增殖障礙和細(xì)胞死亡。F2異前列腺素是由花生四烯酸的非酶自由基引發(fā)的過氧化作用產(chǎn)生的，常被用作脂質(zhì)損傷過程中氧化應(yīng)激的準(zhǔn)確量度[17]。在F2異前列腺素中，8-iso-PGF2α具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性、非飲食性和內(nèi)源性抗氧化劑調(diào)節(jié)特性以及易于在生物學(xué)中檢測液體等優(yōu)勢，被認(rèn)為是評估內(nèi)源性脂質(zhì)過氧化作用的非侵入性分析因子[20]。評估生物液體中8-iso-PGF2α的水平可以被認(rèn)為是研究自由基和脂質(zhì)過氧化在癌癥發(fā)病機(jī)制中作用的一種新穎且可靠的生物標(biāo)志物[21]。T-AOC可以迅速反映出對外部刺激的補(bǔ)償能力和生物體內(nèi)自由基的代謝能力[22]。本研究結(jié)果顯示，COPD組患者血清中氧化產(chǎn)物8-iso-PGF2α表達(dá)高于對照組，抗氧化產(chǎn)物T-AOC表達(dá)低于對照組，表明COPD患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激。

EMT的調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜，可表現(xiàn)在不同水平上（表觀遺傳修飾、轉(zhuǎn)錄控制、選擇性剪接、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位等），COPD患者肺組織中EMT的調(diào)控作用和機(jī)制目前不明確，Courtney等[23]研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化生長因子β可通過Smad及Wnt/β-catenin途徑誘導(dǎo)COPD中EMT的發(fā)生，本課題組前期研究[24]數(shù)據(jù)表明，TGFβ-NOX4-ROS途徑通過促進(jìn)氣道平滑肌增殖變性誘發(fā)氣道重塑，因此推測ROS可能是EMT發(fā)生、發(fā)展的重要調(diào)控位點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，COPD組肺組織小氣道中存在明顯的EMT現(xiàn)象，同時(shí)COPD組患者血清中伴有氧化標(biāo)記物的增高和抗氧化物的降低，COPD組體內(nèi)存在明顯的氧化應(yīng)激，推測氧化應(yīng)激與EMT的發(fā)生密切相關(guān)，氧化應(yīng)激通過某種途徑誘發(fā)COPD患者EMT的出現(xiàn)，誘發(fā)COPD患者出氣道重塑等病理改變。因此抗氧化藥物的研究應(yīng)用可能對COPD患者EMT的逆轉(zhuǎn)起到一定作用。

綜上所述，COPD患者肺組織存在明顯的EMT及氧化應(yīng)激現(xiàn)象，氧化應(yīng)激可能通過某種機(jī)制參與調(diào)控EMT機(jī)制，參與COPD的發(fā)生、發(fā)展，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。