黃芩苷修復腫瘤壞死因子-α誘導MCR-5細胞損傷的實驗研究

王 麗，梁 軍，張 煒，黃 菱，萬巧鳳

（1.寧夏醫科大學基礎醫學院病原生物學與免疫學系，銀川750004；2.寧夏醫科大學藥學院，銀川750004）

中藥黃芩富含多種黃酮類化合物，如黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素等，其中黃芩苷是其主要活性成分，具有消炎[1]、抗氧化等[2]多種生物學作用，迄今為止，有關黃芩苷修復損傷方面的研究鮮有報道。因前期研究發現黃芩苷對流感病毒致肺損傷小鼠具有良好的保護作用[3]，所以本研究擬以人胚肺成纖維細胞（MCR-5）為研究對象，以誘導細胞損傷具有顯著作用的腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）為誘導劑，旨在進一步探討黃芩苷修復細胞損傷的作用及可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細胞

MCR-5購自北納創聯生物科技研究院。

1.2 藥品

黃芩苷購自南京春秋生物工程有限公司，批號21967-41-9，純度大于98%，用RPMI 1640不完全培養基（含1/1000 DMSO）將其配制成1 g·L-1的母液，用0.22 μm的濾器過濾除菌，分裝后保存于-20℃。

1.3 試劑

TNF-α（Cyagen，貨號HETNP-01011）；β-半乳糖苷酶染色試劑盒（碧云天，貨號C0602）；微小RNA（miRNA）提取試劑盒（QIAGEN公司）；miRNA反轉錄試劑盒（ABI公司）；Trizol（Invitrogen公司）；Real-time PCR擴增試劑盒（Roche公司）；沉默信息調節因子1（SIRT1）兔抗人抗體（EPitomics，貨號3894-1）；周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）鼠抗人抗體（Abcam，貨號ab54576）；蛋白質分子量Marker（Bio-Rad，貨號161-0374）；HRP標記山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物技術有限公司，貨號ZB-2301）；GAPDH一抗（Abcam，貨號ab8245）；Western blot其他試劑由本室配備。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養及TNF-α誘導細胞 將MCR-5細胞用完全培養液（含10%胎牛血清、100 μg·mL-1鏈霉素、100 U·mL-1青霉素及DMEM）培養于37℃、5% CO2培養箱中，傳代3～4次后選狀態良好的細胞，以終濃度為10 ng·mL-1的TNF-α進行誘導7 d[4]，采用β-半乳糖苷酶染色試劑檢測TNF-α誘導的MCR-5細胞活性。

1.4.2 β-半乳糖苷酶染色檢測TNF-α誘導的MCR-5細胞損傷情況 本實驗設3個組。正常組為未經TNF-α誘導的MCR-5細胞按5×104個/mL接種于直徑為35 mm的培養皿中，加完全培養液；另2組為將TNF-α誘導7 d的MCR-5細胞接種于6個培養皿，待細胞貼壁后分為TNF-α誘導組（TNF-α10 ng·mL-1）和黃芩苷處理組（TNFα10 ng·mL-1+黃芩苷100 μg·mL-1），每組3個皿，作用72 h，進行細胞損傷檢測。根據β-半乳糖苷酶染色試劑盒規定流程，完成相關操作后采用顯微鏡觀察，在10倍物鏡下，每組每個皿中隨機拍5個視野，每個視野中計數50個細胞，統計損傷細胞并計算細胞損傷率。細胞損傷率（%）=損傷細胞數/總細胞數×100%[5]。

1.4.3 RT-qPCR及Western blot實驗分組[6]本實驗細胞分組及藥物處理同1.4.2所述，每組14個皿。于37℃、5% CO2條件下分別培養48 h及72 h后，收集各組細胞。每個時間點，每組中3個皿用來提取蛋白，另外4個皿用來提取總RNA。1.4.4 RT-qPCR檢測MCR-5細胞miR-22[6]表達水平 提取各組細胞總mRNA，紫外分光光度計定量。反轉錄體系（15 μL）：RT Master Mix 7 μL；RNA 5 μL；5×RT primer（150 nmol·L-1）3 μL。條件：16℃30 min；60℃30 min；72℃5 min。引物序列：U6上游5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，U6下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-22上游5’-ATGGTTCGTGCGAAGCTGCCAG TTGAAGAA-3’；miR-22下游5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；miR-22 RT莖 環 引 物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCA CTG-GATACGACACAGTTCT-3’。Real-Time PCR體系（20 μL）：cDNA 2 μL；引物1和引物2各1 μL（10 pmol·μL-1）；SYBR Mix 10 μL；ddH2O 6 μL。避光置于熒光定量PCR儀（ABI 7500）檢測miR-22表達，U6作為miR-22內參，采用2-ΔΔCT計算各個樣本目的基因的表達[7]。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4.5 Western blot檢測MCR-5細胞SIRT1及CDK6蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量。取總蛋白40 μg，以1×樣品緩沖液配平上樣體積，沸水浴5 min后上樣，SDS-PAGE電泳（濃縮膠80 V，分離膠100 V），半干電轉膜儀轉膜（30 mA，90 min）；封閉后分別加入SIRT1、CDK6及GAPDH一抗（SIRT1一抗稀釋度為1∶1 000；CDK6為1∶2000；GAPDH一抗為1∶10 000），4℃過夜；TBS-T漂洗液洗膜10 min，共3次；加入HRP標記的二抗（SIRT1二抗稀釋度為1∶2 000；CDK6為1∶2 000；GAPDH為1∶5 000），37℃振蕩60 min；加入ECL發光液，X線膠片曝光，經顯影、定影、掃描后觀察結果。應用Image-Pro Plus軟件對掃描圖像的目的條帶進行灰度分析，各目的條帶與GAPDH的灰度比值為目的蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞損傷率的影響

與正常MCR-5細胞比較，TNF-α誘導的MCR-5細胞的損傷率升高（P＜0.01）；與TNF-α誘導的MCR-5細胞比較，黃芩苷處理組細胞的損傷率降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞損傷率的影響（±s，n=15）

2.2 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞miR-22表達的影響

與同時間點的正常MCR-5細胞比較，TNFα誘導的MCR-5細胞miR-22在48 h及72 h表達水平均升高（P＜0.01）；與同時間點的TNF-α誘導的MCR-5細胞比較，黃芩苷處理48 h、72 h的miR-22表達水平均降低（P均＜0.05）。另外，正常組及黃芩苷處理組的兩個時間點差異無統計學意義，而TNF-α誘導損傷組兩個時間點差異有統計學意義（P＜0.05）；說明黃芩苷可有效抑制TNF-α誘導的MCR-5細胞miR-22的表達，見圖2。

圖2 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞miR-22表達的影響（±s，n=4）

2.3 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞SIRT1蛋白表達的影響

與同時間的正常MCR-5細胞比較，TNF-α誘導的MCR-5細胞組SIRT1蛋白在48 h及72 h表達水平均降低（P均＜0.01），與同時間TNF-α誘導的MCR-5細胞組比較，黃芩苷處理48 h及72 h的SIRT1蛋白表達水平均升高（P均＜0.05）。另外，正常組的兩個時間點差異無統計學意義，而TNF-α誘導組及黃芩苷處理組兩個時間點差異明顯（P均＜0.05）。說明黃芩苷可促進TNF-α誘導的MCR-5細胞SIRT1蛋白的表達，見圖3。

2.4 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞CDK6蛋白表達的影響

與同時間點的正常MCR-5細胞比較，TNFα誘導的MCR-5細胞CDK6蛋白在48 h及72 h表達水平均降低（P均＜0.01），與同時間點TNF-α誘導的MCR-5細胞比較，黃芩苷處理48 h、72 h的CDK6蛋白表達水平均升高（P均＜0.05）。另外，正常組的48 h和72 h差異無統計學意義，而TNF-α誘導組及黃芩苷處理組48 h和72 h差異均有統計學意義（P均＜0.05）。說明黃芩苷可促進TNF-α誘導的MCR-5細胞CDK6蛋白的表達，見圖4。

圖4 黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞CDK6蛋白表達的影響（±s，n=3）

3 討論

TNF-α是一種重要的炎癥因子，在誘導細胞衰老損傷方面作用顯著[8]。過去認為細胞衰老表現為細胞生長抑制和增殖潛能衰竭，細胞的表型、結構和功能等方面發生許多不可逆的改變[9]。近期有研究表明衰老損傷可以被逆轉[10]。SIRT1是NAD+依賴的Ⅲ類組蛋白去乙酰化酶[11]，其生理功能是除去乙酰基，使DNA鏈能夠緊密纏繞在一起，達到沉默基因的功能[12]。哺乳動物中，SIRT1是與SIR2同源性最高的同系物，俗稱長壽基因，SIRT1蛋白主要分布在細胞核中，通過其對組蛋白和非組蛋白的去乙?；饔谜{節基因轉錄和靶蛋白活性，與細胞衰老密切相關[13]。周期蛋白依賴性激酶（CDK），是與細胞周期進程相對應的一套Ser/Thr激酶系統。各CDK和cyclin結合形成異二聚體，其中CDK為催化亞基，cyclin為調節亞基，不同的cyclin/CDK復合物通過CDK活性，催化不同底物磷酸化，從而實現對細胞周期不同時段的推進和轉化，其中CDK6與cyclin D1、cyclin D2及cyclin D3結合，促進G1/S轉移[14]。

圖3黃芩苷對TNF-α誘導的MCR-5細胞SIRT1蛋白表達的影響（±s，n=3）

miRNA是長度為18~25個核苷酸的非編碼的小分子RNA。它可與靶基因的3’-UTR區結合，使靶基因翻譯受到抑制或引起靶基因降解，從而發揮負向調節作用，在維持機體正常的生理代謝過程中發揮重要的作用[15]。miR-22是新發現的一個衰老相關的miRNA。有研究[16]發現，miR-22在人類衰老的成纖維細胞和上皮細胞中表達上調，SIRT1和CDK6是miR-22的靶基因，miR-22可通過抑制SIRT1和CDK6的表達使pRb去磷酸化，進而引起細胞損傷。

本課題組前期做了大量有關黃芩苷抗病毒、消炎及抗氧化等功效的實驗研究，當發現黃芩苷對流感病毒致小鼠肺損傷具有良好的保護作用后，決定在細胞水平對黃芩苷修復損傷進行研究。

結果表明，TNF-α誘導MCR-5細胞損傷率為65.2%，黃芩苷可明顯修復MCR-5細胞的損傷，損傷率為52.4%；其可通過下調損傷細胞的miR-22表達、促進SIRT1及CDK6的轉錄與翻譯，從而促進細胞從G1期向S期轉移，進而增強損傷細胞的生命活力及延長其生命周期?？梢?，黃芩苷具有修復損傷細胞的作用，其作用可能與下調miR-22表達、增強SIRT1-CDK6路徑的信號轉導相關。

本研究從細胞水平對黃芩苷修復損傷進行了初步實驗研究，至于黃芩苷對損傷模型動物的影響如何，有待于進一步實驗研究確定。