驢乳清粉水解物改善D-半乳糖衰老小鼠衰老的相關機制研究

楊佳慶，陳興浩，巫首燕，劉 慶，曹佳怡，張福梅

（1.西北民族大學 生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學 醫學部，甘肅 蘭州 730030；3.西北民族大學 中國-馬來西亞國家聯合實驗室，甘肅 蘭州 730030；4.甘南牦牛乳研究院，甘肅 甘南 747000）

生物活性肽是蛋白質中20個天然氨基酸以不同組成和排列方式構成的從二肽到復雜的線性、環形結構的不同肽類的總稱，是源于蛋白質的多功能化合物，對生命體的生命活動具有積極作用，并最終影響機體健康。乳源性活性肽因為其獨特的營養價值備受關注[1]。國內外研究發現，乳清蛋白的水解產物不具有較強的羥自由基清除率[2-5]，但具有降低血清膽固醇[6]等作用。

在所有物種的乳制品中，驢乳的組成更接近母乳，且對患牛奶過敏的嬰兒致敏性較小[6]。此外，驢奶還具有減輕氧化應激、抗腫瘤、抗病毒、抗菌、抗炎和改善免疫功能等作用[7]，是適合老年人的營養乳品。

目前已證實乳清蛋白水解物能夠清除自由基[8]，延緩機體衰老，但驢乳清粉水解物對衰老的研究未見報道。因此，本實驗采用驢乳清粉水解物連續干預D-半乳糖衰老小鼠6周，監測其體重、血清中SOD活性和MDA含量、跳臺實驗、負重游泳等指標，探究驢乳清粉水解物改善D-半乳糖衰老小鼠機體衰老的相關機制，為驢乳高附加產品的開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌性昆明小鼠，由蘭州大學基礎醫學院醫學實驗中心提供；丙二醛（MDA）試劑盒和超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所有限公司；D-半乳糖和VC，購自大連美侖生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

電熱恒溫水浴鍋、DT-200小鼠跳臺測試儀、游泳箱（50 cm×40 cm×60 cm有機玻璃槽）。

1.3 方法

1.3.1 驢乳清粉水解物的制備 稱取0.5 g驢乳清粉，用蒸餾水配成30 mg/L的底物濃度，90℃預處理5 min，降溫至最適溫度，調節pH值到酶的最適值。在酶最適宜的反應溫度下用恒溫磁力攪拌并稱取適量蛋白酶放在溶液中。反應進行時，依據所測結果加入1 mol/L的NaOH溶液或HCI溶液進行修正，保證pH值的恒定在到達預定時間調整至7.0左右。水解終止后進行水浴滅酶（水浴條件為100℃），9 000 r/min，離心10 min，倒掉上清液，剩下即為驢乳清粉水解物。

1.3.2 水解度DH的測定 根據pH-stat法（Alder-Nissen[9]，1986）測定驢乳清粉水解率。

1.3.3 衰老模型的制備 選取25～30 g健康成年雌性小鼠65只，正常對照組（12只）不做任何干預，其余小鼠頸背部注射0.25 ml/20 g體重的10%D-半乳糖生理鹽水，每日1次，連續注射42 d，用來制備D-半乳糖衰老小鼠。

1.3.4 實驗分組 衰老模型制作成功后，小鼠先進行4 d的適應性游泳訓練，按照表1分組。腹腔注射標準為每只小鼠每天注射0.25 ml/20 g體重的10%D-半乳糖。

表1 驢乳清粉水解物干預衰老小鼠實驗分組

1.3.5 負重游泳 采用50 cm×40 cm×60 cm有機玻璃槽，水深約35 cm，水溫25±0.5℃。置小鼠在游泳箱中游泳（每周1次），鼠尾根部負荷5%體重的鉛皮，并做好標記，記錄小鼠游泳情況，至小鼠力竭時間（即小鼠從入水游泳開始記錄時間至口鼻沒入水中8 s，無抬頭）。力竭后立即將小鼠用吹風機吹干，置于籠中正常飼喂。

1.3.6 跳臺實驗 在跳臺訓練時先將小鼠置于跳臺測試箱內3 min，保證小鼠適應環境，然后通入36 V電流，在小鼠受電擊后，其正常反應是跳到安全平臺以躲避電擊[10]。記錄10 min內小鼠跳下逃避臺的次數并進行統計與分析。

1.3.7 指標檢測 用驢乳清粉水解物干預1～6周，檢測體重；參考Farhangi等[11]方法，計算體重增長率。6周后對小鼠采血，在4℃冰箱中靜置2 h，再用離心機離心，3 500 r/min，15 min。按照說明書步驟檢測血清中SOD活力和MDA含量。

2 結果

2.1 驢乳清粉水解物水解率

經分析計算，驢乳清粉水解率為9.9%。

2.2 驢乳清粉水解物對D-半乳糖衰老小鼠體重的影響

由圖1可知，NS-N、DWPPL、DWPPM和VC組，體重增長率與干預時間均呈正相關，且NS-N組增長率最高，DWPPL、DWPPM和VC組3組體重增長率相似，均與NS組有統計學意義。DWPPH組與NS組的體重增長率均呈下降趨勢。

圖1 不同劑量驢乳清粉水解物干預D-半乳糖衰老小鼠體重增長率的變化

2.3 小鼠血清抗氧化活性的變化

由圖2可知，NS與NS-N相比，血清中SOD活力值下降，而MDA的含量卻明顯上升，具有統計學差異。驢乳清粉水解物和VC干預后，NS與乳清粉水解物低、中、高劑量組相比，MDA含量明顯下降，SOD活力顯著上升，且低、中劑量組與VC組結果相近，僅高劑量組MDA含量與NS組無統計學差異。

圖2 小鼠血清中SOD活力MDA的含量變化

2.4 小鼠跳臺實驗

小鼠跳臺實驗屬一次性刺激回避反應實驗，是間接反映機體學習記憶能力的行為學方法。由表2可知，D-半乳糖造模后，衰老小鼠跳臺實驗潛伏期均明顯下降，與正常對照組有統計學差異；隨著驢乳清水解物干預時間的延長，DWPPL和DWPPM潛伏期較干預前明顯延長，DWPPH組與衰老組間無明顯變化。0周、3周、6周錯誤次數組間均無統計學差異。

表2 驢乳清粉水解物干預衰老小鼠跳臺實驗結果

2.5 負重游泳

由表3可知，衰老模型建成后，游泳時間均有所下降，與正常對照組有統計學差異；隨著低、中濃度驢乳清水解物的逐漸干預，游泳時間延長且與衰老組均有統計學差異。但高濃度組游泳時間無變化，表明高濃度水解物對小鼠抗氧化能力效果不明顯。

表3 驢乳清粉水解物干預衰老小鼠負重游泳實驗結果

3 討論

大量研究發現，隨著年齡的增長，體重會逐漸下降，同樣肥胖的人更容易衰老[12]。本實驗中D-半乳糖衰老小鼠隨干預時間的延長，體重明顯下降，而低、中濃度驢乳清水解物和VC均能逆轉衰老導致的體重下降。

Denham Harman認為衰老過程中細胞功能的改變是由ROS的積累導致生物分子氧化和細胞損傷。血清內SOD的活力是機體清除自由基能力的體現，同時MDA含量是機體脂質過氧化物的重要顯現，SOD活力和MDA含量與氧化應激和衰老密切相關[13,14]。本實驗中，衰老組的小鼠MDA含量較正常組升高，而SOD活性則降低，但在添加低、中濃度驢乳清粉水解物后MDA含量明顯下降，SOD活性升高，且與VC陽性對照組結果無顯著差異，說明低、中濃度驢乳清粉水解物在機體內具有抗氧化活性，可以減輕衰老導致的氧化應激。

小鼠跳臺實驗結果表明，D-半乳糖衰老小鼠潛伏期明顯下降，隨著驢乳清水解物干預時間的延長，DWPPL和DWPPM潛伏期較干預前明顯延長，0周、3周、6周時，10 min內小鼠出現錯誤次數正常組較其他組少，組間均無統計學差異。表明D-半乳糖可通過半乳糖醇在細胞內堆積，提高機體氧化應激，引起細胞出現功能障礙，學習記憶能力下降；而干預VC和低、中濃度驢乳清水解物能降低氧化應激，進而恢復部分學習記憶能力。

中樞疲勞理論認為，耐力運動過程中，在肌糖原和肝糖原大量消耗的同時，血液中的支鏈氨基酸也隨之降低，但游離色氨酸水平升高，大量色氨酸進入腦屏障轉變為5-羥色胺，其可抑制中樞興奮性，從而產生嗜睡和疲勞的感覺。本實驗中，衰老小鼠的負重游泳時間較正常對照組明顯下降，隨著低、中濃度驢乳清水解物的逐漸干預，游泳時間延長且與衰老組均有統計學差異。證明低、中濃度驢乳清水解物在機體內具有較好的抗疲勞作用。其可能機制是驢乳清水解物中乳清蛋白水解肽能在機體中更快地參與肌肉合成過程，同時乳清蛋白含有支鏈氨基酸，可以阻斷色氨酸的轉運，在延緩疲勞的同時，支鏈氨基酸阻止肌肉分解，促進肌肉合成，對于修復運動損傷具有重要作用。

高濃度驢乳清粉水解物在體重增長率、跳臺實驗和負重游泳等實驗結果與衰老組相比無差異，雖能降低衰老過程中的MDA含量，提高SOD活性，但仍與衰老組無統計學意義。造成這一結果的可能原因是大量氨基酸代謝脫氨，形成過量尿素在體內堆積導致機體腎損傷，進而與低、中濃度產生差異，具體損傷機制仍需進一步研究。本試驗結果表明驢乳清水解物低、中濃度在機體內具有較好的抗氧化、抗疲勞和提高記憶力的作用。