農桿菌介導大麥遺傳轉化的研究進展

危文波

(省部共建青稞和牦牛種質資源與遺傳改良國家重點實驗室/西藏自治區(qū)農牧科學院農業(yè)研究所，西藏 拉薩 850032)

大麥屬于禾本科大麥屬，具有麩皮的為皮大麥，沒有的是裸大麥。當前，大麥育種研究的主要目標是培育優(yōu)質高產、抗逆性好的大麥品種，而隨著分子生物學的快速發(fā)展，通過農桿菌介導的方法可以幫助育種工作者快速達成這一目標。

1 大麥遺傳轉化研究進展

目前，農桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法和電擊轉化法等大麥遺傳轉化的常用的方法中，農桿菌介導法理論和機理相對清晰，其中根癌農桿菌是農桿菌介導法中運用最多的。農桿菌介導法是將外源基因通過農桿菌侵染導入大麥中，并使外源基因穩(wěn)定表達遺傳的方法。而且在基因轉化的研究得到迅速發(fā)展之后，再生獲得的大麥植株占遺傳轉化獲得的植株的80%[1]。農桿菌介導法具有轉基因沉默少、拷貝數(shù)量低、遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點，這都是基因槍法不具備的[2]。不同大麥基因型[3]、受體的選擇[4]、培養(yǎng)基配方[5]、共培養(yǎng)過程[6]等因素都會影響農桿菌介導的大麥遺傳轉化。目前，大麥品種“Golden Promise”相比較于其它品種的再生能力更強，也作為大麥遺傳轉化的主要受體。為誘導幼胚的愈傷組織發(fā)生及其持續(xù)生長，在FHG基礎培養(yǎng)基中添加Dicamba比2，4-D更加明顯[5]。早在1997年，Tingay等[3]將大麥品種“Golden Promise”的幼胚作為受體，以農桿菌作為載體，將外源Bar基因和gus基因轉入，并收獲轉化成功的大麥植株54個，但其轉化成功率僅有4.2%。

1.1 農桿菌菌株

當前農桿菌介導遺傳轉化普遍效率較低，是因為菌株活力時常發(fā)生變化，影響侵染的有效性；也是由于不同類型植株對農桿菌菌株的侵染能力有較大的差異，因而在實際的操作過程中應當篩選最敏感或最合適的農桿菌菌株[7]。Kazuhito等[8]在1992年報道了應用LBA4404轉化成功的例子，并表現(xiàn)出比EHA105更高的轉化效率，雖然高毒性農桿菌AGL1要超出LBA4404的轉化效率2～3倍，但是該農桿菌的過量生長很大程度地影響了侵染后植株的再生。

1.2 菌液濃度和侵染時間

菌液濃度對轉化頻率的影響很大，菌液濃度過低，附著于外植體愈傷組織切口處的農桿菌量不夠，轉化效率降低；菌液濃度過高，外植體誘導的愈傷組織會褐變致死，很難得到抗性愈傷組織。對大多數(shù)植物受體來說，侵染效率最高的菌液濃度OD600值是在0.2～0.6范圍內[9]。除菌液濃度外，菌液侵染外植體的時長也會對轉化的結果產生影響。附著于外植體誘導產生的愈傷組織切口的農桿菌數(shù)量會隨著侵染外植體時長的增加而增加，侵染時間過短，農桿菌菌液數(shù)量過少，不足于侵染愈傷組織；侵染時間過長，菌液長時間浸泡造成傷害。兩種情況都不利于外源基因的遺傳轉化，因此篩選合適的侵染時間會直接影響到大麥的遺傳轉化效率[10]。

1.3 共培養(yǎng)時間

研究表明，在附著外植體后農桿菌并不立即轉化，而是在經過約16h的“細胞調節(jié)期”之后才會發(fā)生T-DNA的轉移[2]。通過Shrawat等[6]的研究表明，農桿菌侵染大麥后條件20～25℃溫度環(huán)境下共培養(yǎng)2～3d，可使轉化效率達到最佳。可見，轉化效率是受到共培養(yǎng)時間的影響，而且不同植株的外植體，相同農桿菌的最佳共培養(yǎng)時間也是不同的。

2 應用

農桿菌介導法轉化功能基因為大麥品質的改良提供了技術支撐，其中包括大麥的抗逆性特別是非生物脅迫耐受性、籽粒產量以及大麥的麥芽和營養(yǎng)品質等。

2.1 非生物脅迫耐性

在植株的生長過程中，外界不同程度的光、溫、水、氣等氣候條件和營養(yǎng)條件都會產生有利或不利的影響，而植株本身就含有可以減少或降低非生物脅迫的基因。如何有效地發(fā)現(xiàn)并利用這些功能基因，改善大麥植株的進化周期和適應過程，也是農作物育種者的努力方向。

2.1.1 金屬離子耐受性

小麥品種“Triticumaestivum”對高濃度鋁離子的耐受性特別強，通過研究發(fā)現(xiàn)，是ALMT1的基因在發(fā)揮作用。Delhaize等[11]在大麥品種“Golden Promise”中轉入該基因，其轉化植株表現(xiàn)出類似小麥品種的基因表達量且穩(wěn)定，在鋁離子較高的水培和酸性很強的土壤中均表現(xiàn)良好。

2.1.2 抗旱性與抗寒性

小麥的2個CBF/DREB轉錄因子持續(xù)過量表達也控制多種脅迫應答基因的活性。Morran等[12]將小麥的TaDREB2和TaDREB3 2個轉錄因子通過農桿菌介導遺傳轉化法導入大麥植株內，轉化植株體內外源基因的持續(xù)過量表達減緩了其生長發(fā)育，影響其受粉，導致產量下降；但是在嚴重缺水情況下，TaDREB2和TaDREB3的轉化植株比非轉化植株的對照的生存狀態(tài)更好。定量PCR檢測結果表明，提高轉化大麥植株中TaDREB2和TaDREB3表達量，可以增加CBF/DREB基因以及LEA/COR/DHN的表達，從而有效改善轉化植株的抗旱性和抗寒性。

2.2 籽粒產量

細胞激動素是一種植物激素，其在各個組織器官中的活性受到細胞激動素脫氫酶(CKX)的調節(jié)。Zalewski等[13]通過農桿菌介導法將含HvCKX1部分編碼基因的干涉載體轉入大麥品種“Golden Promise”，以RNAi的方式降低了CKX1的表達。與野生型比較，轉基因大麥T0株系根部CKX1活性明顯降低，產生的種子數(shù)量和千粒重顯著增加，提高了作物的產量，為通過基因水平調控CKX達到增產目的提供了潛在的可能性。

2.3 麥芽品質

啤酒釀造的基礎材料是麥芽，如何利用外源功能基因去改良麥芽的品質一直是啤酒大麥育種工作者的追求。在大麥啤酒的釀造過程中，如何有效控制影響釀造效率的因素，包括有可發(fā)酵糖類的數(shù)量、麥芽汁粘的稠度和過濾狀況、細胞壁和淀粉的水解的淀粉酶和葡聚糖酶的數(shù)量等都影響著麥芽的品質。劉雷[14]等2005年向大麥幼胚中導入TrxS基因，獲得了T0代轉基因植株49株,PCR檢測結果顯示，目的基因已成功轉入，T2代轉基因植株檢測結果表明，該大麥植株基因組完整遺傳TrxS基因。通過測定發(fā)芽種子中淀粉酶的活性發(fā)現(xiàn)，對比野生型植株，轉基因植株的α-淀粉酶活力高出0.63倍，β-淀粉酶活力則高出11.1ug·min-1。

2.4 營養(yǎng)品質

大麥在土壤中吸收到的鋅元素的數(shù)量影響其最終的產量和營養(yǎng)品質，而鋅元素運輸載體AtZIP1基因影響著鋅元素的攝取速度。Ramesh等[15]以大麥品種Golden Promise為受體，利用農桿菌將擬南芥中該外源功能基因轉入其中，并使其過量表達，實驗結果表明，在相同條件下的土壤中，遺傳轉化的大麥植株籽粒不管是鋅元素、鎂元素以及鐵元素的總含量，還是每粒種子中的平均含量均比正常大麥中的含量更高。微量元素的含量一定程度上影響著作物的營養(yǎng)品質，而調控攝取微量元素的機制，農桿菌介導法為其提供了途徑和方法。

盡管大麥遺傳轉化研究進展迅猛，特別是青稞全基因組測序的完成和轉化品種的不斷擴大，但還是有很多問題限制其發(fā)展，包括轉化完成后不同大麥品種的再生體系不盡相同，轉化植株體內外源基因表達的穩(wěn)定性和組織特異性，以及要考慮和研究遺傳轉化大麥的環(huán)境與生物安全性等[16]。在解決了這些限制因素后，相信在功能基因的挖掘、生理機制等基礎領域的研究和食品以及育種等生產領域的研究，農桿菌介導的遺傳轉化有著更加亮眼的未來。