基于多成分含量測定結合化學計量法評價水族藥材罵廣瓦質量

曾文輝，龔千鋒，楊民榮

1.江西省藥品檢查員中心，江西 贛州 341000；2.江西中醫藥大學，江西 南昌 330000；3.贛州市綜合檢驗檢測院食品藥品檢測所，江西 贛州 341000

罵廣瓦為馬兜鈴科植物金耳環Asarum insignediels 的全草。具有溫經散寒、消腫化瘀、行氣止痛的功效。多用于治療風寒痹痛、跌打損傷等癥［1］。是我國水族人民常用藥材，又名為金耳環，被廣泛使用。主要分布在廣西、貴州、福建等地，在《廣西省中藥材標準》1990 版、《廣西壯族質量標準（第二卷）》中均以金耳環之名收載，控制項簡單，不足以控制其藥材質量。近年來，馬兜鈴科的植物因含馬兜鈴酸類成分而被關注，所含有的馬兜鈴酸I 及馬兜鈴內酰胺類化合物都具有腎細胞毒性［2-4］，而罵廣瓦作為馬兜鈴科植物，對此，有必要對其含有的馬兜鈴酸類成分進行檢測和研究。據文獻報道［5］，罵廣瓦主要含有黃酮類、氨基酸、糖類和揮發油等，其中甲基丁香酚具有降壓、鎮靜、抗炎等功效［6-8］，相關藥理表明，罵廣瓦具有鎮痛抗炎、止咳祛痰的功效［9-10］。但目前缺乏有效的質量控制，對罵廣瓦的應用開發具有一定的限制，本文在參考相關文獻［11-12］基礎上，建立了高效液相色譜法測量罵廣瓦中5 個含量（包括馬兜鈴酸類和甲基丁香酚）的方法，并結合統計學方法對不同產地的樣品進行區別分類探索，為系統的評價藥材質量提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AD 型高效液相色譜儀，AUW220D型電子天平（十萬分之一，日本島津公司）；BS224S型電子天平（萬分之一，Sartorius）；KQ5200 型水浴鍋（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

甲基丁香酚（批號：111642-200301，純度為99.0%，中國食品藥品檢定研究院）；馬兜鈴酸I（批號：110746-201912，純度為99.1%，中國食品藥品檢定研究院）；馬兜鈴酸Ⅱ（批號：191012-04，純度為99.5%），馬兜鈴內酰胺I（批號：190925-01，純度為98.5%），馬兜鈴酮（批號：200721-02，純度為98.7%），均購自于成都普思生物科技股份有限公司，供含量測定使用。甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。

本實驗收集到不同批次的罵廣瓦樣品共14 批，樣品信息見表1，樣品經江西中醫藥大學龔千鋒教授鑒定為罵廣瓦Asarum insignediels.

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 罵廣瓦藥材供試品溶液

精密稱取罵廣瓦藥材粉末（過四號篩）1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱重，回流提取30 min，稱重補重，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續濾液作為供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備

精密稱取甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴酮對照品適量，分別加甲醇制成每1 mL 含甲基丁香酚123.2 μg、馬兜鈴酸Ⅱ25.2 μg、馬兜鈴內酰胺I 3.6 μg、馬兜鈴酸I6.2 μg及馬兜鈴酮22.1 μg 的溶液，備用。

2.3 色譜條件

色譜柱：Welch C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；以乙腈（A）-7.0 mmol/L 磷酸緩沖溶液（pH=2.3）（B）為流動相，梯度洗脫（0 →15 min，A：40%；15 →25 min，A：40%～45%；25 →55 min，A：45%～80%；55 →60 min，A：80%～40%）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃。罵廣瓦藥材供試品溶液中5 個成分分離度良好，如圖1 中A、B 圖。

圖1 混合對照品（A）和罵廣瓦供試品（B）色譜圖

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系試驗精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液，用甲醇按比例稀釋成不同濃度的混合對照品溶液（母液分別稀釋5 倍、10 倍、50 倍、100 倍、250 倍）。在“2.3”色譜條件下，對母液及稀釋的不同濃度的對照品進行測定。以對照品進樣濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，得到表2 中各對照品的回歸方程及相關系數。

表2 線性關系

2.4.2 精密度試驗分別精密吸取混合對照品溶液10 μL，按“2.3”項下色譜條件，重復進樣6 次，記錄甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴酮的峰面積值，結果顯示5 個成分的RSD 分別0.31%、0.11%、0.54%、0.39%及0.22%。表明儀器的精密性較好。

2.4.3 穩定性試驗取供試品溶液（批號：S11），精密吸取供試品溶液10 μL，按“2.3”項下色譜條件，按一定的間隔時間進樣，測定供試品溶液中甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I、馬兜鈴酸I和馬兜鈴酮峰面積值，結果顯示在24 h 內5 個成分的RSD 為0.24%、1.25%、0.78%、1.02%及0.81%。表明供試品在24 h 內穩定。

2.4.4 重復性試驗取已知罵廣瓦藥材（批號：S11）約1.0 g，共六份，照“2.1”項下實驗方法制成供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，測定供試品溶液中甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I、馬兜鈴酸I 和馬兜鈴酮峰面積值，計算含量，結果顯示，甲基丁香酚平均含量為0.052 0 mg/g（RSD 為1.22%）；馬兜鈴酸Ⅱ平均含量為0.031 0 mg/g（RSD 為1.45%）、馬兜鈴內酰胺I 平均含量為0.034 0 mg/g（RSD 為0.85%）、馬兜鈴酸I 平均含量為0.038 0 mg/g（RSD 為1.15%）及馬兜鈴酮平均含量為0.021 0 mg/g（RSD 為1.63%）。表明該方法重現性良好。

2.4.5 平均加樣回收率試驗稱取已知含量的樣品（批號：S11）約1.0 g 六份，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入已配制的甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I、馬兜鈴酸I、馬兜鈴酮濃度分別為0.001 0 mg/mL、0.000 6 mg/mL、0.000 6 mg/mL、0.000 8 mg/mL、0.000 4 mg/mL 的70%甲醇溶液50 mL，按照“2.1”項下方法制成供試品溶液，測定溶液中5 個成分的含量，計算回收率，結果見表3。

表3 5個成分的加樣回收率

2.5 樣品的含量測定

取14 批不同罵廣瓦藥材，分別照“2.1”項下方法平行制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，每份進樣3 次，計算5 個成分的含量，結果見表4。

表4 不同產地罵廣瓦中5個成分含量測定結果（mg/g）

2.6 化學模式識別研究

采用SPSS 21.0 軟件將表4 中5 個成分的定量數據進行統計分析，以Person 相關性進行間距分析，將14 個批次進行分類，結果由圖2A 所示。總體來看，14 個批次不能顯著的進行分類區別，各產地各批次的差異難以區分。此外，對5 個成分數據進行主成分因子分析，計算成分的特征值和貢獻率，同時，計算相關系數矩陣、主成分特征值、累積貢獻率等，得到綜合評分，對各批次罵廣瓦進行評價。結果見表5，碎石圖見圖2B。由表5 和圖2B 可知，5 個成分中，前3 個成分（甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I 的累積方差貢獻率87.279%）的特征值較大（>1），若以貢獻率80%以上作為標準，前3 個成分即可反映整體信息。

表5 主成分因子的特征值和方差貢獻率

圖2 罵廣瓦5個成分含量聚類樹狀關系圖（A）和碎石圖（B）

收集的14 批罵廣瓦中5 個成分定量數據，運用SIMCA 13.0 軟件進行主成分分析，從圖3 中的PCA 圖可以看出，批次S1-S5、S6-S10 及S11-S14分別對應廣西、廣東和福建的樣品，可大致的區分，但存在一定的離散偏差；從OPLS-DA 圖中，可清楚把三個地方收集的樣品進行區分，可直觀的發現不同地理來源罵廣瓦的差異。

圖3 罵廣瓦PCA圖（A）和OPLS-DA分析圖（B）

3 討論

本實驗對供試品提取溶劑（甲醇、乙醇、水及不同比例的甲醇水、乙醇水等），不同流動相組成及不同檢測波長進行了篩選研究。通過比較發現，70%甲醇作為溶劑時，提取的成分最多，峰響應良好，分離度優良，故選用70%甲醇作為本研究中樣品的提取溶劑。選用乙腈-磷酸緩沖鹽作為流動相較于乙腈-氨水系統、乙腈-三乙胺等系統在色譜峰基線、峰的對稱性等方面有優勢；梯度程序洗脫，5 個待測峰分離良好。用二極管陣列檢測器（PDA），在不同的波長如203 nm、230 nm、270 nm、310 nm 等條件下進行峰形的比較，發現檢測器波長在230 nm時，峰信號響應強，出峰較全面，分離度良好，故本研究選用230 nm 作為檢測波長。

由表4 中數據可知，14 批樣品中，上述5 個成分中甲基丁香酚的平均含量較其他成分含量最大，且不同產地的樣品有一定的差異，這與其起鎮痛抗炎作用可能存在直接關系；而馬兜鈴酸類及其內酰胺類成分都幾乎小于100 μg/g 的范圍內，對于控制其毒性要求，規定一定的限量范圍具有指導作用。對于質量標志物的選擇，功效成分和有毒成分均可作為選擇的依據參考，可根據用藥選擇進行考慮；不同產地的5 個成分在含量存在一定的差異，數據經統計學軟件分析，甲基丁香酚、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴內酰胺I 可作為影響差異的主要成分，OPLSDA 圖也可直觀的區別不同產地的樣品。所以在不同來源的樣品中比較中，可選擇影響因素大的3 個成分進行說明，而針對功效定量選擇，則可把甲基丁香酚作為指標依據；而對于毒性的控制，則可選擇馬兜鈴酸類及其內酰胺類成分進行限量控制，并需要結合相應的毒理實驗。本研究建立的罵廣瓦的含量測定方法可用于評價該藥材的質量，具有特異性、選擇性，更能體現質量標志物以控制產品質量。同時，為后期的藥理、毒理-量效關系的研究提供一定的基礎。