黃芪甲苷激活AMPK 改善非酒精性脂肪肝病小鼠肝臟脂質沉積

韋曉虹，楊小穎，胡芳，梁藹明，郭一帆，孫遼

1.中山大學附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海 519000；2.廣州市第一人民醫(yī)院，廣東 廣州 518000

非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease,NAFLD）是除去酒精因素，其他原因導致脂肪在肝細胞內過度沉積為主要病理特征的臨床綜合征。據估計，全球NAFLD 患病率約25%［1］，2016 年中國NAFLD 估計總病例數為2.43 億［2］，現已取代慢性乙型肝炎成為第一大慢性肝臟疾病。未經有效治療的NAFLD 易于從單純性脂肪變性逐漸演變?yōu)榉蔷凭灾靖窝住⒏卫w維化以及肝硬化，甚至發(fā)展至肝癌［3］。此外，NAFLD 也是2 型糖尿病等代謝性疾病的獨立危險因素［4］。然而，除了生活方式干預外，目前尚無NAFLD 的有效治療藥物。深入探究NAFLD發(fā)生發(fā)展中的關鍵調節(jié)靶點及其藥物開發(fā)，是防治NAFLD 亟待解決的問題。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）作為細胞“能量感受器”，在NAFLD的發(fā)病和進展中起著關鍵作用，通過介導脂質合成、內質網應激、氧化應激、脂肪酸氧化等途徑改善肝臟脂肪變性［5-7］。這些效應使得AMPK 成為NAFLD的潛在治療靶點。因此尋找安全有效的AMPK 激活劑是目前NAFLD 治療中的研究焦點之一。

黃芪甲苷（astragaloside Ⅳ，AS-Ⅳ）是從我國傳統(tǒng)中藥黃芪中提取的有效單體活性成分，有抗炎、抗氧化應激、抗纖維化、降糖、調脂、免疫調節(jié)等藥理作用［8］。課題組前期研究發(fā)現：AS-Ⅳ能通過活化AMPK，減少肝細胞脂質從頭合成和改善內質網應激，從而減輕游離脂肪酸誘導的肝細胞脂質沉積［9］，在高脂高糖飲食誘導的NAFLD 小鼠模型中同樣觀察到AS-Ⅳ能改善肝臟脂質沉積［10］。但AS-Ⅳ是否通過激活AMPK 在體內發(fā)揮作用尚未清楚。因此，本研究通過高脂高糖飲食構建NAFLD小鼠模型，探討AS-Ⅳ是否通過AMPK 發(fā)揮對NAFLD 小鼠肝臟脂質沉積的改善作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物SPF 級5 周齡雄性C57BL/6 小鼠24只，購自廣東省醫(yī)學動物實驗中心（合格證編號為：NO.44007200044791），飼養(yǎng)于中山大學附屬第五醫(yī)院實驗動物中心屏障環(huán)境［許可證號：SYXK（粵）2018-0188］，小鼠分籠喂養(yǎng)，自由進食、飲水，12 h光/暗周期交替，室溫22 ℃～26 ℃。動物實驗經醫(yī)院倫理委員會審批通過，編號為：中大五院［2016］倫字第（K59-1）號。

1.1.2 主要試劑與儀器高脂飼料（D12492）購于廣東省醫(yī)學動物實驗中心；標準普通飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司；AS-Ⅳ購自上海研瑾生物科技有限公司；1%羧甲基纖維素（CMC）、果糖和葡萄糖購自上海超研生物科技有限公司；伊紅染色液購自廣州華奇盛生物科技有限公司；蘇木素染色液購自biosharp；中性樹膠購自中國上海懿洋儀器有限公司；油紅O 染料購自廣州捷倍斯生物科技有限公司，甘油明膠購自北京索萊寶科技有限公司；PVDF 膜購自美國millipore 公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自南京凱基公司；p-AMPK、AMPK、β-actin、羊抗兔IgG抗體購自美國CST公司；3D 光交聯(lián)芯片購自美國Plexera Bioscience；高分辨率質譜分析儀購自美國Thermo Scientific；肝細胞株（L02）購自廣州瓦盾生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 NAFLD 小鼠模型建立及干預5 周齡雄性C57BL/6小鼠標準普通飼料適應性喂養(yǎng)1 周后，隨機數字表法分為正常飲食組（CON）、高脂高糖飲食組（HFD）、高脂高糖飲食+AS-Ⅳ組（HFD+AS-Ⅳ），每組8 只。其中正常飲食：20%脂肪+60%蛋白質+20%碳水化合物；高脂飲食主要包含60%脂肪+20%蛋白質+20%碳水化合物；高糖飲食是以55%果糖、45%葡萄糖的比例配制成42 g/L。AS-Ⅳ用1%CMC 溶解后按60 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)13 周。實驗結束后采用1%戊巴比妥鈉麻醉，頸椎脫臼法處死小鼠，留取肝臟組織標本。

1.2.2 HE 染色觀察肝臟組織切片新鮮肝臟組織用10%中性甲醛溶液固定24 h，梯度酒精常規(guī)脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，連續(xù)切片（厚度4 μm），進行HE 染色。切片常規(guī)經二甲苯脫蠟、梯度酒精水化；蘇木素浸泡3 min，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍1 min，伊紅酒精浸染3 min，梯度酒精脫水，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.2.3 油紅O 染色觀察肝臟組織切片新鮮肝臟組織用包埋劑包埋后置于-80 ℃冰箱保存，然后進行連續(xù)切片（厚度10 μm），切片置于-20 ℃冰箱保存。染色時，肝臟冰凍切片室溫回溫，4%多聚甲醛固定10 min，蒸餾水浸洗，洗掉包埋劑；60%異丙醇浸洗2 min，便于著色；油紅O 工作液染色30 min 后，60%異丙醇調色20 s，蒸餾水浸洗，蘇木素復染30 s，鹽酸酒精分化1 s，蒸餾水浸洗2 次，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察結果。

1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測肝臟AMPK蛋白表達水平根據試劑盒說明書提取小鼠肝臟組織總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE 電泳，350 mA 恒流4 h 將蛋白轉移到PVDF 膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗（AMPK、p-AMPK、β-actin），4 ℃孵育過夜(至少12 h)，TBS 緩沖液洗膜，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，TBS 洗膜后，采用凝膠成像系統(tǒng)掃描顯像并保持。使用Image-Pro Plus 軟件進行灰度相對定量分析，以β-actin 作為內參進行校正，計算目的蛋白與內參蛋白的相對表達量。

1.2.5 高通量芯片技術篩選肝細胞中與AS-Ⅳ作用的潛在靶蛋白并模擬相互作用模式在肝細胞（L02）中加入細胞裂解液進行超聲破碎，4 ℃離心10 min后取上清保存?zhèn)溆谩S-Ⅳ固定到三維芯片表面,后放置于光交聯(lián)儀內進行光交聯(lián)反應，每個孔加入100 μL 肝細胞裂解液，4 ℃過夜進行結合反應；每孔加入80 μL 的 DTT，56 ℃孵育60 min，室溫冷卻；加入IAM 溶液至終濃度50 mmol/L 室溫暗處孵育45 min；加入等體積50 mmol/L NH4HCO3（pH=7.8），用1.5 mL 超濾管濃縮，重復4～5 次；采用BCA 試劑盒測定蛋白質濃度；取約100 μg 蛋白質進行酶切：按Trypsin 酶與底物蛋白的量之比在1∶20～1∶100之間加入酶液，37 ℃孵育8 h～16 h；酶解液過C18柱，用2 mL 漂洗液洗滌2 次，用1 mL 洗脫液洗下樣本，收集，真空離心濃縮樣品。將分離后的肽段直接進入質譜儀Thermo Scientific Q Exactive 進行檢測鑒定，質譜原始文件經過MaxQuant 搜庫（版本1.5.6.0）。最后利用SYBYL 軟件進行分子模擬對接，模擬AS-Ⅳ與靶蛋白相互作用細節(jié)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 實驗結果

2.1 AS-Ⅳ改善高脂高糖飲食誘導的NAFLD 小鼠肝臟脂質沉積

使用高脂高糖飲食構建NAFLD 小鼠模型，同時給予AS-Ⅳ干預13 周。圖1A 顯示：與CON 組相比，HFD 組小鼠肝臟明顯增大，給予AS-Ⅳ干預后，NAFLD 小鼠的肝臟體積減?。籋E 染色結果顯示HFD 組小鼠較CON 組小鼠肝臟脂滴形成明顯增多，而給予AS-Ⅳ干預后，肝臟脂滴形成明顯減少（圖1B）。油紅O 染色觀察到：與CON 組相比，HFD 組小鼠肝臟脂質沉積增加，AS-Ⅳ干預可以減輕NAFLD 小鼠肝臟脂質沉積（圖1C）。

圖1 AS-Ⅳ改善高脂高糖飲食誘導的小鼠肝臟脂質沉積：A.小鼠肝臟大體照片；B.小鼠肝臟組織切片HE染色（光鏡×400）；C.小鼠肝臟組織切片油紅O染色（光鏡×400）

2.2 AS-Ⅳ上調高脂高糖誘導的NAFLD 小鼠肝臟AMPK 磷酸化水平

Western blot 結果發(fā)現：與CON 組相比，高脂高糖飲食誘導的NAFLD 小鼠肝臟p-AMPK 及AMPK 水平降低（P<0.01）；給予AS-Ⅳ干預后，p-AMPK 及AMPK 的蛋白水平上調（P<0.01），見圖2。

圖2 AS-Ⅳ上調高脂高糖誘導的 NAFLD小鼠肝臟AMPK磷酸化水平：A.小鼠肝臟組織蛋白Western blot檢測；B.對圖A的定量分析

2.3 AS-Ⅳ與AMPK-α 亞基直接結合

高通量芯片技術結果顯示：肝細胞中AMPKα1是AS-Ⅳ作用潛在靶蛋白（表1）；進一步分子對接模擬顯示：潛在AS-Ⅳ結合位點位于自抑制多肽片段與AMPKα 亞基組成的口袋中（圖3C），且有別于目前已知的激動劑結合位點（圖3A）和核苷酸結合位點（圖3B）。

圖3 潛在AS-Ⅳ結合位點在AMPK全酶中的位置

表1 肝細胞（L02）中與AS-Ⅳ作用的靶蛋白

3 討論

非酒精性脂肪肝病是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病，目前缺乏有效的藥物治療手段。本研究以C57BL/6 小鼠為研究對象，通過高脂高糖飲食構建NAFLD 小鼠模型，觀察到AS-Ⅳ可以減輕NAFLD 小鼠的肝臟脂質沉積，同時上調AMPK磷酸化水平，這與本課題組已發(fā)表文章以及他人研究結果一致［10-11］。我們前期在游離脂肪酸誘導的HepG2 細胞和小鼠原代肝細胞脂質沉積模型中發(fā)現：AS-Ⅳ通過激活AMPK 上調肝臟脂質從頭合成限速酶乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）和關鍵轉錄因子固醇調節(jié)元件結合蛋白-1c（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）的磷酸化水平，抑制SREBP-1c 核內轉移，下調脂質合成基因的mRNA 水平，抑制肝臟脂質從頭合成，并能降低內質網應激相關蛋白的表達水平從而改善肝細胞脂質沉積［9］。另外，已有的研究證明AMPK 還能介導氧化應激、炎癥、脂肪酸氧化等改善肝臟脂肪變性［7］。AS-Ⅳ通過激活AMPK 途徑有望成為NAFLD 的有效治療藥物。

AMPK 是一種異源三聚體蛋白，由高度保守的α、β 和γ 3 個亞單位組成；其中α 亞單位是起催化作用的核心部位，存在2 種基因所編碼的異構體（α1/α2），其中α1 在細胞中廣泛存在［12］。α 亞單位通過激酶區(qū)域內蘇氨酸172（Thr172）的磷酸化，或通過自抑制區(qū)域（auto inhibitory area,AID）延緩Thr172 的去磷酸化激活AMPK［13］。AMPK 的激活方式有直接和間接兩種方式。AMPK間接激動劑如：二甲雙胍、噻唑烷二酮、姜黃素、白藜蘆醇等，主要通過升高AMP/ATP 和（或）ADP/ATP 比值，間接激活AMPK，但其改善代謝的作用是否特異依賴于AMPK 的活化，難以界定［14］。因此AMPK 直接激動劑相對間接激動劑具有更好的特異性，更具藥物開發(fā)潛質。

目前，針對不同AMPK 亞型的直接激動劑研究取得了一定進展，如直接結合于AMPK γ 亞基的阿卡地新（AICAR），可以激活不同組織的AMPK,調節(jié)糖代謝（Merck＆Co.公司）；直接結合于AMPKβ 亞基的A-769662，可以降低ob/ob 小鼠血糖和肝臟三酰甘油水平。此外，GSK 公司、Pfizer公司分別開發(fā)了吡咯并吡啶酮類及吲哚酸類AMPK直接激活劑。然后在研的AMPK 直接激活劑普遍存在生物利用度低、激動效率低及副作用大等缺陷，直接影響其臨床應用前景［14］。AS-Ⅳ是中草藥黃芪中提取的有效單體活性成分，其化學結構式與現發(fā)現的AMPK 激活分子以及核苷酸均不同［15］。本研究發(fā)現AS-Ⅳ可以與AMPKα1 直接結合，進一步分子對接模擬結果顯示：AS-Ⅳ相互作用區(qū)域位于AMPKα 亞基的自抑制多肽片段位置，有別于已知的底物或激活分子。因此AS-Ⅳ與AMPK 的結合模式有可能成為新型AMPK 活性調節(jié)模式。后續(xù)進一步深入研究AS-Ⅳ激活AMPK 的分子機制及結構基礎，為后期改建或優(yōu)化直接活化AMPK 的AS-Ⅳ衍生物提供科學依據，不僅為開發(fā)NAFLD治療藥物提供新的線索，同時為開發(fā)中藥單體治療藥物研究提供有益的借鑒和研究策略。

4 結論

本研究通過高脂高糖飲食構建NAFLD 小鼠模型，發(fā)現AS-Ⅳ能改善NAFLD 小鼠的肝臟脂質沉積，且這一作用可能與直接激活AMPK 有關，但更具體的機制有待進一步證實，從而為AS-Ⅳ治療NAFLD 提供理論依據。