小麥中嘔吐毒素檢測方法的研究

馬宏偉，劉永智

（1.鞍山市糧油質(zhì)量衛(wèi)生監(jiān)測站，遼寧鞍山 114000；2.丹東市糧食質(zhì)量監(jiān)測站，遼寧丹東 118000）

1 嘔吐毒素的危害與最高限值

1.1 嘔吐毒素的危害

從化學(xué)性質(zhì)分析來看，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），又稱嘔吐毒素，其之所以被稱為嘔吐毒素是因為人及其他動物在大量食用該物質(zhì)后，會引發(fā)機體嘔吐反應(yīng)。結(jié)合毒理學(xué)研究結(jié)果，發(fā)現(xiàn)嘔吐毒素具備免疫毒性、細(xì)胞毒性、神經(jīng)毒性等毒性，當(dāng)人及動物攝入一定量的DON后，輕則出現(xiàn)嘔吐、乏力、頭暈，重則引起腹瀉、臟器損傷、免疫功能障礙等急性中毒癥狀，因此，關(guān)于嘔吐毒素的研究已成為業(yè)內(nèi)乃至社會廣泛關(guān)注的熱點，尤其是國家食品衛(wèi)生安全監(jiān)督部門，都迫切希望能找到一種快速、高效、便捷、準(zhǔn)確度高的檢測方法，確保超標(biāo)嘔吐毒素的作物及其制品的檢出，保障人們的食品衛(wèi)生安全[1]。

1.2 嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)

伴隨著相關(guān)機構(gòu)對嘔吐毒素研究工作的進(jìn)一步深入，以及人們對食品衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步提高，人們對小麥、大豆、玉米等作物及其制品的真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的要求較高。當(dāng)前，世界上已有37個國家與組織對小麥及其制品嘔吐毒素設(shè)定了最高限值標(biāo)準(zhǔn)，例如，歐盟規(guī)定未加工硬質(zhì)小麥嘔吐毒素＜1 750 μg/kg，由于我國居民膳食結(jié)構(gòu)與歐盟人不同，小麥?zhǔn)称窋z入量較大，因此，在小麥嘔吐毒素限量標(biāo)準(zhǔn)上，比歐盟等各國要求更加嚴(yán)格，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定中國小麥嘔吐毒素限量為≤1 000 μg/kg，這一標(biāo)準(zhǔn)限值也成為中國各級政府、質(zhì)檢機構(gòu)監(jiān)管食品中真菌毒素的唯一標(biāo)準(zhǔn)，更是中國小麥及其制品生產(chǎn)、倉儲、進(jìn)出口質(zhì)檢中對于嘔吐毒素控制的重要指標(biāo)，一旦檢出小麥嘔吐毒素添加量超過此限值，可直接勒令其丟棄，并查明毒素來源，加強防控，從源頭上解決小麥嘔吐毒素污染超標(biāo)問題[2]。

2 小麥中嘔吐毒素檢測方法的研究

2.1 高效液相色譜法

稱取小麥樣品25 g，研碎置于250 mL三角瓶中，并加入HO(CH2CH2O)nH 5 g、水100 mL，混合均勻，靜置 20 min,過濾后用免疫親和柱凈化，同時用高效液相色譜-紫外檢測器進(jìn)行測定。以此方法測定結(jié)果為認(rèn)定值，并用酶聯(lián)免疫測定法檢測，對比兩種檢測法的測定結(jié)果。

2.2 酶聯(lián)免疫測定法

（1）同一批試驗樣品小麥稱取5.0 g，置于具塞三角瓶中，同時加入60%甲醇水溶液25.0 mL，緩慢振蕩20 min后，用定性濾紙進(jìn)行過濾；取過濾液1 mL，加水4 mL，搖勻待檢測。將試劑置于室溫（20～25 ℃）1 h以上，注意，此過程中每種液體試劑需在使用前搖勻，嚴(yán)格控制溫度（20～25 ℃）。

（2）將樣本與標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔平行排放，并按序編號，同時準(zhǔn)確記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在位置，取標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50 μL到對應(yīng)的微孔中，同時陸續(xù)加入酶標(biāo)物50 μL/孔、抗試劑50 μL/孔，緩慢振蕩，并用蓋板膜覆蓋，靜置于25 ℃避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，而后小心揭開蓋板膜，甩出孔內(nèi)液體，各孔再加入洗滌液250 μL，充分洗滌4～5次（間隔10 s/次），洗滌完成后置于吸水紙上拍干[3]。

（3）加入底物液100 μL/孔，振蕩均勻后覆蓋蓋板膜，置于25 ℃避光環(huán)境下反應(yīng)15 min。

（4）每孔加入終止液50 μL，輕緩振蕩、搖勻，設(shè)定酶標(biāo)儀450 nm開始檢測，得出各OD值，并進(jìn)行準(zhǔn)確記錄。

3 結(jié)果與分析

檢測結(jié)果顯示，酶聯(lián)免疫法正確度范圍為90.0%～ 134.6%，平均為105.7%（見表1）。

由表1可知，作為傳統(tǒng)的小麥嘔吐毒素測定方法－酶聯(lián)免疫分析法檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度較高（105.7%）。相較于高效液相色譜法，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）快速、靈敏、準(zhǔn)確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設(shè)備，且對樣品純度要求低，特異性強，特別適用于大批量樣品的檢測，發(fā)展迅速，簡化了樣品預(yù)處理和純化過程。但是由于免疫酶的活性非常不穩(wěn)定，在應(yīng)用過程中很容易受到操作條件的影響，反應(yīng)試劑需低溫保存。在實際操作過程中很難達(dá)到這一要求，使得免疫酶的活性大大降低，從而影響到檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。應(yīng)用時還必須通過多次洗滌，才能使反應(yīng)產(chǎn)物和游離底物進(jìn)行分離，影響到結(jié)果的重復(fù)性，而且檢測時間較長，無法滿足現(xiàn)場快速檢測的要求。相信隨著相關(guān)研究工作的進(jìn)一步深入，其適用性將進(jìn)一步增強[4-5]。

表1 酶聯(lián)免疫法正確度分析

4 結(jié)論

為滿足日益提升的糧食質(zhì)量安全快速檢測標(biāo)準(zhǔn)，本文基于同一批次小麥試樣進(jìn)行高效液相色譜法與酶聯(lián)免疫法檢測結(jié)果的對比分析，發(fā)現(xiàn)相較于傳統(tǒng)的高效液相色譜法檢測結(jié)果，酶聯(lián)免疫法的正確度范圍在90.0%～134.6%，平均為105.7%，具備大范圍推廣應(yīng)用的特質(zhì)；相信隨著研究力度的不斷加大，會有越來越多的高效、便捷、快速的檢測方法應(yīng)用于糧食嘔吐毒素檢測中，為保障糧食質(zhì)量安全檢測提供便利。