小兒咳喘靈顆粒質量標準提升

劉薇，肖文濤，楊群，鄧維

1.九江市食品藥品檢驗所，江西 九江 332000；2.江西省藥品檢驗檢測研究院，國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，江西省藥品與醫療器械質量工程技術研究中心，江西 南昌 330029

小兒咳喘靈顆粒是由麻黃、金銀花、板藍根、苦杏仁、甘草、石膏和瓜蔞七味藥組成的成方制劑，收錄于《衛生部藥品標準中藥成方制劑》第四冊（WS3-B-0688-91），具有宣肺、清熱，止咳、祛痰、平喘功效［1］。臨床常用于上呼吸道感染，氣管炎，肺炎，咳嗽等［2］。現行質量標準項下僅有兩項化學鑒別，未涉及薄層色譜鑒別及含量測定指標和方法,無法對處方中的有效成分進行質量控制。本研究擬用薄層色譜法對制劑中的苦杏仁中的苦杏仁苷進行定性鑒別，對處方中5 種成分鹽酸麻黃堿、（R，S）-告依春、綠原酸、木犀草苷、甘草苷的含量用同一液相色譜系統同時測定，為進一步提高小兒咳喘靈顆粒質量標準提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695-2695 高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；YIY-UL300W-C 型超聲波清洗器（上海藝源超聲設備有限公司）；BSA124S 型電子天平（德國sartorius 公司）；BP211D 型電子天平（德國sartorius 公司）；硅膠G 薄層板（10 cm×20 cm，德國默克公司）。

1.2 材料

鹽酸麻黃堿（批號為171241-201007，含量以99.7%計）；（R，S）-告依春（批號為111753-201106，含量以100% 計）；綠原酸（批號為110753-201716，含量以98.0%計）；木犀草苷（批號為111720-200504，含量以100%計）；甘草苷（批號為111610-201005，含量以94.9%計）；苦杏仁苷（批號為110820-201808，含量以88.2%計）對照品購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇和磷酸為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。3 批小兒咳喘靈顆粒樣品（批號：190405、190512、191203，規格為每袋2 g）均購自四川恩威制藥有限公司，依次編號為A1～A3。

2 方法與結果

2.1 苦杏仁苷TLC 鑒別

供試品溶液：取小兒咳喘靈顆粒6 g，加乙醚低溫超聲30 min，棄去乙醚液，藥渣揮干；加甲醇30 mL 超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水5 mL 使溶解，通過D101 型大孔吸附樹脂柱（內徑1.5 cm，長8 cm，加水20 mL 預洗一次），棄去水液，用氨試液30 mL 洗脫，棄去氨液，再用水10 mL洗脫，棄去水液，用20%乙醇溶液30 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL 使溶解，即得［3］。對照品溶液：取苦杏仁苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含2 mg 的溶液。按處方比例和制法制備缺苦杏仁的陰性對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，吸取供試品溶液3 μL，對照品溶液與陰性對照品溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）5～10 ℃放置12 h 的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以磷鉬酸硫酸溶液，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點且陰性對照無干擾。結果見圖1（日光）。

圖1 薄層色譜圖

2.2 5 種成分的含量測定［4-15］

2.2.1 色譜條件 采用Venusil MP C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸；梯度洗脫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：0～15 min，207 nm；15～25 min，327 nm；25～35 min，237 nm；35～40 min，350 nm；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序表

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取鹽酸麻黃堿對照品15.79 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，取出，放冷加適量甲醇定容，制成629.70 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取綠原酸對照品9.32 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成365.30 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取告依春對照品9.66 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min，放冷，甲醇定容，制成386.40 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取甘草苷對照品8.01 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成304.00 μg/mL 的對照品儲備液。精密稱取木樨草苷對照品9.17 mg，置25 mL 容量瓶中，超聲處理15 min，加適量甲醇定容，制成366.80 μg/mL 的對照品儲備液。

2.2.3 樣品溶液的制備 取樣品，研細，從中稱取約2 g，精密稱定，加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，放冷后，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得樣品溶液。

2.2.4 專屬性實驗 分別吸取供試品溶液、對照品溶液以及陰性對照溶液各10 μL，注入液相色譜儀測定，比較供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液色譜圖。結果表明供試品中五種色譜峰與雜質峰有較好的色譜分離，陰性對照無干擾。見圖2。

圖2 高效液相色譜圖：A.對照品溶液；B.小兒咳喘靈顆粒樣品溶液；C.陰性對照溶液

2.2.5 線性關系的考察 取綠原酸對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.65、7.31、14.61、21.92、29.22、36.50 μg 綠原酸的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=21 084.595 2X+28.329 1，r=0.999，綠原酸在3.65～36.50 μg/ mL 之間呈良好的線性。

取鹽酸麻黃堿對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含6.29、12.59、25.18、37.78、50.37、62.97 μg 鹽酸麻黃堿的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=25 351.509X-5 999.754 3，r=0.999，鹽酸麻黃堿在6.29～62.97 μg/ mL 之間呈良好的線性。

取告依春對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.86、7.72、15.45、23.18、30.91、38.64 μg告依春的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=180 916.440 2X-10 717.480 5，r=0.999,告依春在3.86～38.64 μg/mL之間呈良好的線性。

取木樨草苷對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.67、7.34、14.67、22.01、29.34、36.68 μg木樨草苷的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=41 563.933 2X-3 956.141 3，r=0.999，木犀草苷在3.67～36.68 μg/mL 之間呈良好的線性。

取甘草苷對照品儲備液，分別加適量甲醇制成1 mL 中含3.04、6.08、12.16、18.24、24.32、30.40 μg 甘草苷的標準系列溶液，使用高效液相色譜儀進行測定，以其質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為Y=22 763.873 5X-391.572 6，r=0.999,甘草苷在3.04～30.40 μg/ mL 之間呈良好的線性。

2.2.6 精密度試驗 取濃度為36.50 μg/mL 的綠原酸對照品溶液，按上述色譜條件連續測定6 次峰面積，RSD 值為0.40%。取濃度為62.97 μg/mL 的鹽酸麻黃堿對照品溶液，按上述色譜條件連續測定6次峰面積，RSD 值為0.33%。取濃度為38.64 μg/mL的告依春對照品溶液，按上述色譜條件連續測定6次峰面積，RSD 值為0.29%。取濃度為36.68 μg/mL的木樨草苷對照品溶液，按上述色譜條件連續測定6 次，RSD 值為0.33%。取濃度為30.40 μg/mL 的甘草苷對照品溶液，按上述色譜條件連續測定6 次峰面積，RSD 值為0.26%。證明精密度良好。

2.2.7 穩定性試驗 精密稱取小兒咳喘靈顆粒2 g，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，精密吸取供試品溶液（批號：191203）10 μL，分別放置0、2、4、8、12、24 h后進樣測定，結果表明樣品溶液中綠原酸、鹽酸麻黃堿、告依春、木樨草苷、甘草苷在24 h 內峰面積無明顯變化，RSD 分別為1.2%、1.1%、1.6%、1.8%、1.3%。

2.2.8 回收率試驗 精密稱取樣品1.0 g，共六份，置25 mL 量瓶中，分別加入+含鹽酸麻黃堿對照品（0.103 mg/mL）、綠原酸對照品（4.040 mg/mL）、告依春對照品（0.204 mg/mL）、甘草苷對照品（0.458 mg/mL）和木樨草苷對照品（0.101 mg/mL）各0.8、1.0、1.2 mL，加入甲醇15 mL，超聲處理（功率300 W，頻率25 kHz）20 min，定容，搖勻，濾過，按上述色譜條件測定，計算回收率。結果見表2～6。

表2 鹽酸麻黃堿回收率

表3 綠原酸回收率

表4 告依春回收率

表5 甘草苷回收率

表6 木樨草苷回收率

2.2.9 樣品含量測定 精密稱取小兒咳喘靈顆粒樣品適量，按“2.2.3”的方法制備樣品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件重復進樣測定2 次，計算樣品中5 種成分的含量，結果見表7。

表7 樣品中5種成分的含量測定結果（mg/袋）

3 討論

3.1 苦杏仁苷的薄層色譜鑒別

現行檢驗標準未對處方中苦杏仁藥材進行質量控制，查閱相關文獻少見小兒咳喘靈顆粒研究方法中對苦杏仁的鑒別方法。在試驗中參考苦杏仁藥材的薄層方法［16］，同時對比用索氏提取、二次回流、超聲提取等不同提取方法，結果分離效果不理想，苦杏仁陰性樣品斑點干擾成分較多。考慮處方中藥材成分互相干擾，組方中有多數含糖成分，會造成不易分離且拖尾等，為了改善分離效果，故用大孔樹脂柱層析法，結果證明用大孔樹脂柱層析法能有效洗脫雜質干擾成分，且分離效果較好，陰性對照無干擾。

3.2 含量提取方法優化

對提取溶劑（甲醇、75%乙醇、50%甲醇、水），提取方法（超聲法、回流法、浸提法），提取時間（10、30、40、60 min）進行了比較，最后確定用50%甲醇超聲處理30 min 為最佳。

3.3 流動相選擇

比較乙腈-0.1%磷酸、甲醇和水兩種系統，其中乙腈-0.1%磷酸峰形及分離度較好，保留時間也較為理想。也考察了磷酸的濃度0.1%、0.2%、0.3%。其中0.1%的磷酸濃度分離效果較好，故選擇表1中的梯度洗脫法。

3.4 檢測波長選擇

木犀草苷的最大波長是350 nm，而鹽酸麻黃堿、（R，S）-告依春、綠原酸、甘草苷分別為207、245、237 nm，不能以同一波長對這5 種成分進行紫外檢測。經實驗用紫外檢測液相色譜法直接切換不同波長進行含量測定方法較為方便，同時在同一個系統中測定5 個組分，故選用波長切換法進行檢測。

本研究對小兒咳喘靈顆粒質量標準進行了相應提升，建立的薄層鑒別和含量測定方法專屬性強，能有效對小兒咳喘靈顆粒的質量進行控制。