大廠茶紫芽品系P113不同季節花青素調控相關基因表達分析

劉霞，李芳，宋勤飛，牛素貞，呂立堂

大廠茶紫芽品系P113不同季節花青素調控相關基因表達分析

劉霞，李芳，宋勤飛，牛素貞*，呂立堂

貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025

為明確大廠茶紫芽品系P113在不同季節花青素積累的分子機理及合成途徑上相關基因的表達特點，對春、夏、秋3個季節的P113一芽二葉進行轉錄組（RNA-Seq）和代謝組（UHPLC-MS/MS）分析。結果顯示，檢測到的10種花青苷衍生物含量隨季節變化，其中4種隨春、夏、秋季節變化呈上調表達，與其葉色表現一致；結構基因表達模式基本一致，均在夏季上調表達，在秋季的表達量與夏季無顯著差異；酶基因獲得的2個差異表達基因均在夏季上調表達；表達模式相似，均在夏季上調表達，且各有1個基因在秋季呈現下調表達；2個基因中有1個在夏季下調表達，1個隨季節變化上調表達；的13個基因均在夏季上調表達，而在秋季呈現不同表達模式；修飾基因在夏季和秋季均出現兩種表達模式；僅獲得1個差異表達基因，隨季節變化上調表達；3個基因中有1個在夏季下調表達，在秋季上調表達，另2個僅在夏季上調表達，在秋季的表達量與夏季無顯著差異；獲得的7個差異表達基因均在夏季上調表達，其中2個在秋季下調表達；調控基因隨季節變化上調表達，對花青素合成有正向調控作用。研究表明，大廠茶紫芽品系P113在不同季節結構基因、修飾基因和調控基因的表達具有一定的時間特性，導致了花青素積累差異。

大廠茶；花青素；差異表達基因

茶樹是世界三大主要飲料作物之一，具有重要的經濟價值。隨著人們生活水平的提高，功能性、特色茶樹品種越來越受到關注。紫芽茶樹品種作為一種富含花青素的特色茶樹資源，其保健功能與高含量的花青素緊密相關，隨著花青素的功能被逐漸闡明，選育富含花青素的特色紫芽茶樹品種受到研究人員的廣泛關注[1-3]。近年來在貴州發現了大量大茶樹資源，表型及生化組分分析發現，這些資源的遺傳多樣性豐富，在品質、抗性、產量等相關性狀上具有很好的優勢。本課題組前期研究篩選出的紫芽品系P113，其芽葉性狀與目前已知的紫芽品種存在顯著差異，在分類上屬于大廠茶（F. CZhang）。茶樹花青素積累量與芽葉顏色深淺呈正相關[4]，茶樹葉片花青素的合成、積累和降解隨葉片發育而變化，受時間、空間和內外因子綜合影響。盡管有一些研究對茶樹花青素代謝進行了初步的探討，部分參與花青素合成的基因已被克隆驗證，但茶樹花青素代謝途徑是一個復雜的網絡結構，受到多個代謝途徑的共同影響，由一系列的酶催化完成[5-7]。此外，不同紫芽資源的內含成分以及葉色調控機理都存在明顯差異，因此很有必要對特異茶樹資源芽葉的葉色調控機理進行探索，為后續的育種應用提供理論基礎。目前高通量測序、基因芯片、代謝組分析和蛋白質組分析等技術已被應用到茶樹花青素合成相關功能基因發掘領域[8]，篩選到多個與茶樹次生代謝、轉錄調控等生物學進程相關的差異基因，并克隆了編碼類黃酮-甲基轉移酶和類黃酮3'-羥化酶的基因[9-11]。

為進一步揭示花青素合成的遺傳機制，本研究以大廠茶變異紫芽品系P113為材料，采用新一代高通量測序技術（RNA-Seq），研究其芽葉在不同季節發育過程中紫化程度和花青素生物合成相關基因的表達情況，篩選出茶樹花青素合成途徑相關基因，并進行功能注釋，解析花青素生物合成及類黃酮生物代謝途徑的轉錄機制，預測控制花青素合成的差異基因，并對差異基因進行GO與KEGG富集分析，為今后進行茶樹葉片花青素合成相關基因的克隆和功能驗證奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

以紫芽品系P113為材料，選自普安縣野生型茶樹群體種，種植在普安縣貴州大學實驗基地內。其表型特征為喬木型，子房5室、無毛，柱頭5裂，果實梅花形，頂芽無毛，花白色，直徑5.8?cm，葉片革質、長14.2?cm、寬6.8?cm（圖1）。材料常規水肥管理，于取材前半年進行修剪后封園，于3月中旬（春）、5月中旬（夏）、8月上旬（秋）分別采集長勢良好、無病蟲害的一芽二葉作為試驗材料，各個時期材料取兩組，一組微波制備干樣用于代謝組檢測，一組液氮速凍超低溫冰箱保存用于轉錄組測序，試驗設3個生物學重復。

1.2 花青素組分測定及總RNA提取

花青素測定參考李智等[12]方法。大廠茶總RNA提取參照Tri-Reagent試劑盒（武漢貝納科技服務有限公司）說明書進行。從大廠茶芽葉中提取總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳測試RNA質量，用Beads[帶有Oligod（T）]對mRNA進行純化，用Qubit RNA Assay Kit進行起始總RNA準確定量，采用Agilent 2100 BioAnalyzer檢測RNA的完整性。取完整性好（28?S∶18?S約為2∶1）、A260∶A280為1.8～2.0、質量濃度≥200?mg·L-1的RNA樣品，置于–80℃冰箱備用。

1.3 cDNA文庫構建與RNA-Seq

選擇質量合格的總RNA作為mRNA測序的建庫起始樣品，Illumina HiSeq TM2000測序平臺對庫檢合格的文庫進行測序獲得raw reads，過濾低質量reads后得到clean reads。以舒茶早基因組作為參考基因組，用Trinity軟件通過序列之間的重疊信息組裝得到contigs，局部組裝得到transcripts，用Tgicl和Phrap軟件對transcripts進行同源聚類和拼接得到unigene。文庫構建與測序皆由武漢貝納科技服務有限公司完成。

1.4 基因差異表達分析

使用HTSeq軟件統計樣品的基因表達水平[13]，樣本合理性選擇皮爾森相關系數的平方（2）檢驗[14]，采用TMM對過濾后的數據進行標準化[15]，采用DESeq對檢測得到的基因進行差異表達分析[16]，差異基因的篩選采用FPKM法，篩選閾值＜0.005及|log2Fold change|＞1，log2Fold change＞0，認為是上調表達，反之為下調表達[17]。篩選出的差異表達基因結果用火山圖進行直觀表示。

2 結果與分析

2.1 花青素代謝物組分分析

紫芽品系P113在春、夏、秋3個季節的芽葉顏色存在明顯的差異（圖2）。通過對紫芽品系P113的花青素進行檢測，得到10種花青苷衍生物（表1）。夏季，P113中的矢車菊素-3--咖啡酰槐糖苷-7--葡萄糖苷、矢車菊素-乙酰基葡萄糖、矢車菊素--丁香酸、矢車菊素-3--葡萄糖苷、飛燕草素-3--葡萄糖苷、矢車菊素-3,5--二葡萄糖苷、飛燕草素-3--蕓香糖苷、天竺葵素-3--葡萄糖苷含量均高于春季；飛燕草素-3--(3'',6''-二丙二酰葡萄糖苷)和錦葵色素-3--葡萄糖苷含量低于春季。秋季，P113中矢車菊素-3--咖啡酰槐糖苷-7--葡萄糖苷、矢車菊素-乙酰基葡萄糖、飛燕草素-3--(3'',6''-二丙二酰葡萄糖苷)、錦葵色素-3--葡萄糖苷、飛燕草-3--葡萄糖苷、天竺葵素-3--葡萄糖苷等含量高于夏季，屬于上調表達，其余花青苷衍生物含量均低于夏季。

2.2 轉錄組測序質量分析

紫芽品系P113春、夏、秋季葉片RNA-Seq分析結果顯示（表2），去除帶接頭和質量低的reads后，獲得clean reads范圍為54?903?686～85?965?732個。堿基識別錯誤率均為0.01%，Q20（質量值≥20的堿基所占百分比）占整個reads長度的97.89%以上，Q30（質量值≥30的堿基所占百分比）占整個reads長度的94.03%以上，GC含量在43.16%～44.24%，測序質量較好，符合進一步分析要求。

圖1 紫芽品系P113花、果、葉片形態特征

圖2 紫芽品系P113不同季節的表型變化

2.3 差異表達基因相關性分析

皮爾森（Pearson）相關性系數是檢驗試驗可靠性和樣本選擇是否合理的重要指標，相關系數越接近1，樣品的相似度越高。對春、夏、秋3個季節基于差異表達基因的樣品間皮爾森相關性分析顯示（表3），春季和夏季、春季和秋季、夏季和秋季之間相關系數大于0.8，均為顯著或極顯著相關。3個季節樣品生物學重復之間相關系數均在極顯著范圍。差異表達基因樣品相關性顯示，試驗的重復性與可靠性均滿足進一步分析的要求。

2.4 不同季節基因差異表達分析

通過對紫芽品系P113的春、夏、秋3個季節轉錄組差異表達分析，將相近兩個季節轉錄組數據進行比對，篩選不同季節差異表達基因。結果顯示，與春季相比，夏季有3?819個差異表達基因，其中2?524個上調，1?295個下調；與夏季相比，秋季有1?768個差異表達基因，其中958個上調，810個下調（圖3）。利用KEGG數據庫，將差異表達基因進行功能注釋和富集分析，夏季的差異表達基因共注釋得到294個代謝通路，主要涉及光合作用、細胞周期、黃酮生物合成、花青素生物合成、異黃酮生物合成及苯丙氨酸代謝和苯丙氨酸生物合成等；秋季的差異表達基因共注釋得到272個代謝通路，主要涉及調節脂肪分解、cAMP信號通路、黃酮生物合成、花青素生物合成、異黃酮生物合成、苯丙氨酸代謝及苯丙氨酸生物合成等。通過篩選得到3個與花青素合成有關的代謝途徑，分別為苯丙氨酸代謝、黃酮生物合成和花青素生物合成，共獲得90個差異表達基因。對差異表達基因進行TPIA（http://teaplant.org）茶樹基因組數據庫比對，比對到參考基因組的有53個，被注釋為14種酶基因，分別是黃酮生物合成途徑中的10種酶基因，苯丙氨酸代謝途徑中的4種酶基因，花青素合成途徑中的1種，未比對到參考基因組的差異表達基因有37個。

表1 不同季節P113的花青素組分含量分析

注：相對定量，通過每個單個峰的面積計算相對定量。A：春季淡紫色芽葉。B：夏季紫紅色芽葉。C：秋季深紫色芽葉。同行不同字母表示差異顯著（＜0.05）；B vs A：夏季與春季相比。C vs B：秋季與夏季相比。FC：差異倍數。↑表示上調，↓表示下調

Note: Relative quantification is calculated by the area of each discrete peak. A: lilac buds and leaves, spring. B: purple buds and leaves, summer. C: dark purple buds and leaves, autumn. The different lowercase letters in the same line indicate significant difference (＜0.05). B vs A: summer compared with spring. C vs B: autumn compared with summer. FC: multiple of difference. ↑ indicates up regulation, ↓ indicates down regulation

表2 紫芽品系P113轉錄組測序數據質量分析

注：A1、A2和A3：春季3個生物學重復。B1、B2和B3：夏季3個生物學重復。C1、C2和C3：秋季3個生物學重復。下同

Note: A1, A2 and A3: three biological repetitions in spring. B1, B2 and B3: three biological repeats in summer. C1, C2 and C3: three biological repeats in autumn. The same below

表3 樣品間的皮爾森相關系數

注：*表示顯著差異（＜0.05），**表示極顯著差異（＜0.01）

Note: * indicates a significant difference (＜0.05), ** indicates a very significant difference (＜0.01)

2.5 花青素合成結構基因的表達分析

對紫芽品系P113不同季節花青素合成相關酶基因進行差異表達分析，結果表明（表4），共獲得10個差異表達的基因，其表達模式基本一致，大多在夏季上調表達，在秋季與夏季無顯著差異。酶基因獲得2個差異表達的基因，其中TEA008357隨著季節變化表達量顯著升高，與花青素含量的積累情況基本一致；TEA027829的表達量夏季高于春季，秋季與夏季差異不顯著。酶基因表達模式基本一致共獲得9個差異表達的基因，其中6個差異表達基因在夏季上調表達，而在秋季與夏季的表達無顯著差異；TEA016716、TEA010588、TEA000503基因則在夏季上調表達，在秋季下調表達。基因有2個差異表達，其中TEA010843在夏季下調表達，TEA034016基因隨季節變化上調表達。基因共獲得13個差異表達的基因，其中TEA002405、TEA013443、TEA014951、TEA020629、TEA023729基因的表達量在夏季上調表達，在秋季的表達量與夏季差異不顯著；TEA010598、TEA024235、TEA025230、TEA033871基因在夏季上調表達，秋季下調表達；TEA010762、TEA018444、TEA023937、TEA023946基因與花青素積累情況相似，隨著季節的變化呈增加趨勢。

2.6 花青素合成修飾基因的表達分析

對紫芽品系P113不同季節芽葉中花青素合成修飾基因的表達分析表明（表5），共有8個差異表達基因，其中TEA015167、TEA027538基因隨季節變化上調表達，夏季表達量高于春季，秋季表達量高于夏季；TEA006624、TEA015016在夏季下調表達，在秋季的表達量與夏季無顯著差異；TEA015375基因在夏季上調表達，在秋季的表達量與夏季差異不顯著；TEA025989基因在夏季上調表達，秋季時下調表達；TEA024761和TEA026458基因在夏季的表達量與春季無顯著差異、而秋季時下調表達。只獲得1個差異表達基因TEA022960，該基因隨季節變化呈上調表達。共有3個差異表達的基因，TEA022238基因在夏季下調表達，在秋季上調表達；TEA025792和TEA025793基因在夏季上調表達，在秋季的表達量與夏季無顯著差異。共有7個差異表達基因，其中TEA000392、TEA012735、TEA018304、TEA023870、TEA030958基因在夏季時表達量均高于春季，夏、秋季差異表達不顯著；TEA022732、TEA029331基因夏季上調表達，秋季下調表達。

表4 不同季節花青素合成結構基因的表達

注：“up”為上調表達，“down”為下調表達，“–”為差異不顯著。下同

Note: “up” means up-regulated expression, “down” means down-regulated expression, and “-“ means no significant. The same below

2.7 花青素合成調控基因的表達分析

對花青素合成相關調控因子、的表達分析表明（表6），在中獲得7個差異基因，其中TEA016380、TEA017105基因隨季節變化上調表達；TEA000421、TEA032260基因在夏季上調表達，秋季和夏季的表達量無顯著差異；TEA000833、TEA019380、TEA032433基因在春季和夏季的表達無顯著差異，秋季表達量相對夏季上調。蛋白中有10個差異基因，TEA028476、TEA026204基因隨季節變化上調表達；TEA029605、TEA029615、TEA014193、TEA014430、TEA018997基因在春季和夏季的表達無顯著差異，在秋季時上調表達；TEA033191、TEA014311、TEA011367基因在夏季上調表達，秋季的表達量與夏季無顯著差異。

3 討論

本研究利用UHPLC-MS/MS對大廠茶紫芽品系P113不同季節芽葉中花青素的代謝物組分進行檢測，在紫芽品系P113芽葉中檢測出10種花青苷衍生物，并對其進行分析。結果顯示，大廠茶紫芽品系P113中10種花青苷衍生物含量隨季節變化，在夏季時除了飛燕草素-3--(3'',6''-二丙二酰葡萄糖苷)和錦葵色素-3--葡萄糖苷相對含量減少外，其他8種花青苷組分含量均高于春季；在秋季時只有5種花青苷含量高于夏季。在10種花青苷衍生物中矢車菊素-3--咖啡酰槐糖苷-7--葡萄糖苷、矢車菊素-乙酰基葡萄糖、飛燕草-3--葡萄糖苷和天竺葵素-3--葡萄糖苷4種花青苷含量分別在夏季和秋季增加，在秋季時含量最高，這與蔣會兵等[18]和Shen等[19]的研究結果一致，這4種花青苷衍生物可能是影響大廠茶紫芽品系P113在不同季節紫化程度不同的原因。

表5 不同季節花青素合成修飾基因的表達分析

表6 大廠茶不同季節花青素合成調控基因的表達

苯丙氨酸解氨酶（PAL）是花青素生物合成過程中的關鍵酶之一，它催化-苯丙氨酸（-Phe）的脫氨基反應生成肉桂酸，為后續花青素的合成提供底物[20]，桃金娘（）果實中基因的表達與果實的顏色變化一致[21]。有研究表明，和基因的表達與花青素的積累呈正相關[22-24]。本研究結果顯示，基因中獲得10個差異基因，表達模式相似，在夏季上調表達，這與花青素積累情況基本一致，進一步驗證了在花青素合成中的重要作用。基因表達情況相似，在夏季和秋季大部分上調表達。是控制天竺葵素合成的關鍵酶[25]，本研究中天竺葵素-3--葡萄糖苷積累量在夏季和秋季均有所增加；在煙草（）中的異源表達導致花青素積累增加，致使花色變深[26]；受到抑制時會影響花青素的積累[27]；基因的表達情況和菊花花瓣中花青素積累一致[28]。研究表明，與存在底物競爭關系[29]，本研究中部分基因在秋季時出現表達量下調情況，這可能是二氫黃酮醇更多地向花青素代謝途徑轉化，通過底物競爭影響了花青素的合成。注釋到中的差異基因存在兩種不同的表達模式，這與其他植物中基因的表達與花青素積累呈正相關不同[30-31]，其功能有待進一步研究。

花青素生物合成過程中修飾基因和是原花青素（PA）合成過程中的關鍵酶基因[32]，可以將無色花色素轉化為兒茶素(+)-C，可以催化花青素形成表兒茶素(–)-EC[33]。本研究中注釋到中的差異基因出現兩種不同的表達模式，在夏季和秋季均下調表達，這與在蘋果中原花青素生物合成涉及的花青素還原酶基因表達相似[34]，推測可能在紫芽品系P113中存在異位表達，其表達模式有待進一步研究。注釋到的差異基因表達量在夏季和秋季均上調，與花青素積累情況相同，因此推測在原花青素生物合成過程中起著積極作用。糖基化有助于植物中花色苷的多樣性和穩定性，屬于花青素糖基化轉移酶中的一種。在擬南芥的研究中敲除突變體中，花青素顯著減少[35]。本研究中的基因表達量在夏季時上調，表明在花青素合成修飾過程中起重要修飾作用。作為木質素合成途徑中的關鍵酶基因，與花青素的生物合成途徑擁有相同的底物4-香豆輔酶A（4-coumaroyl-CoA）[36]，本研究中基因在夏季均上調表達，部分在秋季時下調表達，表明在夏季時可能使底物更多的向木質素合成途徑轉化，秋季時可能更多的向花青素合成途徑轉化，促進花青素的積累。

已知花青素生物合成過程中受到轉錄因子調控，目前對花青素生物合成過程報道最多的調控因子主要是MYB-bHLH-WD40（MBW）復合體[37]。本研究中紫芽品系P113在春、夏、秋3個季節，表達特征與結構基因表達特征基本一致，表明調控因子可能通過正向調控這部分結構基因從而影響花青素積累[38]。轉錄因子在玫瑰花中過表達可以促進花青素生物合成下游基因的表達[39]；在矮牽牛中基因過表達可以提高花青素生物合成過程中基因的表達量[40]。本研究中基因表達水平與花青素積累情況一致，表明可能在花青素生物合成過程中起到正向調控作用。植物花青素合成過程中轉錄因子的穩定表達對花青素積累起著重要作用。在矮牽牛中，轉錄因子可通過調控結構基因，從而調控花青素的積累[41]；在馬鈴薯中，轉錄因子過量表達能調控基因表達，進而加深塊莖表皮顏色[42]。而在本研究中轉錄調控因子未注釋到顯著差異表達的基因，其在紫芽品系P113中是否調控基因的表達有待進一步研究。

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Analysis of Gene Expression Related to Anthocyanin Regulation of ‘P113’ Purple Strain ofF.C.Zhang in Different Seasons

LIU Xia, LI Fang, SONG Qinfei, NIU Suzhen*, LYU Litang

Tea College of Guizhou University, Guiyang 550025, China

In order to clarify the molecular mechanism of anthocyanin accumulation and the expression characteristics of related genes in the synthetic pathway of anthocyanin inF.C.Zhang purple bud line P113 in different seasons, one bud and two leaves of P113 in spring, summer and autumn were analyzed by RNA-Seq and UHPLC-MS/MS. The results show that the 10 anthocyanin contents changed with seasons, and 4 of them were up-regulated with the change of spring,summer and autumn, which were consistent with leaf color phenotypeof ‘P113’. The expression patterns of structural genes,,,,andwere basically the same, which were up-regulated in summer, but not significantlychanged in autumn. The two differentially expressedgenes were up-regulated in summer. The gene expression patterns of,andwere similar, and their expressions were up-regulated in summer and down-regulated in autumn. One of the twogenes was down-regulated in summer, and one was up-regulated with seasonal changes. The 13 genes ofwere all up-regulated in summer, but they showed different expression patterns in autumn. The modifier genehad two expression patterns in summer and autumn. There was only 1 differentially expressed gene inthat was up-regulated with seasonal changes. Among the threegenes, one was down-regulated in summer, up-regulated in autumn, andthe rest two genes were up-regulated in summer, but not significantly changed in autumn. Seven differentially expressedgenes were up-regulated in summer.Two of them down regulated in autumn, and the rest five genes were not significant changed. The regulatory genesandwere up-regulated with seasonal changes, and had a positive relationship with anthocyanin biosynthesis. The results show that the expressions of structural genes, modifier genes and regulatory genes of ‘P113’ (F.C.Zhang) had certain time characteristics in different seasons, which led to the differencesin anthocyanin accumulation.

F.C.Zhang, anthocyanins, differentially expressed genes

S571.1

A

1000-369X(2021)06-789-13

2021-02-22

2021-07-15

貴州省自然科學基金重點項目（黔科合基礎[2019]1404號）、貴州省科技廳農業攻關項目（黔科合支撐[2017]2557、黔科合支撐[2017]2558）、國家自然科學基金（32060700）

劉霞，女，碩士研究生，主要從事茶樹種質資源與遺傳改良研究，liuxia199411@163.com。*通信作者：niusuzhen@163.com

（責任編輯：黃晨）