PCDH15基因變異相關耳聾患者基因型與聽力表型特征分析

施韜關靜李進趙翠 蘭蘭王大勇 王洪陽王秋菊*

1 浙江中醫藥大學醫學技術與信息工程學院（杭州 310053）

2 中國人民解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科醫學部，國家耳鼻咽喉疾病臨床醫學研究中心，解放軍耳鼻咽喉研究所，聾病教育部重點實驗室；聾病防治北京市重點實驗室（北京 100853）

PCDH15變異導致Usher綜合征1型（USH1）或常染色體隱性遺傳性耳聾23型（DFNB23）。USH1是一種以進行性視網膜色素變性（retinitis pig‐mentosa,RP）和先天性感音神經性聽力損失為特征的常染色體隱性疾病，伴有先天性前庭功能障礙，運動發育遲緩、難以保持平衡[1-4]。USH1在視力異常表型出現之前，與非綜合征型耳聾（Non-syn‐dromic hearing loss,NSHL）表型相同，也被稱為擬非綜合征型耳聾（mimics NSHL）[5]。因此，當臨床中發現PCDH15變異的患者，需監測隨訪以鑒別是否可能為USH1。

目前，已報道的PCDH15變異位點為144個（http://www.hgmd.cf.ac.uk/,Update 2020/04），大多為國外報道，且很少有針對PCDH15變異患者的描述，國內相關報道更少。本研究通過新一代測序技術，在4個家系中檢出PCDH15復合雜合變異，并分析4個家系的基因型及表型特征。

1 研究對象

研究對象為2016年3月-2019年6月在解放軍總醫院耳鼻咽喉頭頸外科就診的4個漢族耳聾家系（圖1），共18人，6名患者均為先天性極重度感音神經性耳聾，男性2名、女性4名，分別來自河北、北京、河南、山東；其中3名兒童，3名成人。收集先證者及其父母或家屬血樣，共18份。所有研究對象均已簽署知情同意書，未成年子女由其父母簽署同意書。

圖1 PCDH15變異相關耳聾患者家系及聽力圖。B1：+/+表示c.3441 del A/c.2528 C＞A；A2：患者9月左側植入CI后助聽聽閾；B2：患者29歲雙耳聽閾；C2：患者11月雙耳聽閾；D2：患者10月齡右側植入CI后雙耳聽閾。Fig.1 Pedigrees of deafness families related to variants of PCDH15.B1:+/+mean by c.3441 del A/c.2528 C＞A;A2:The patient’s left hearing threshold after left cochlear implant in 9 months ago;B2:The patient’s binaural hearing threshold in 29 years old;C2:The patient’s binaural hearing threshold in 11 months old;D2:The patient’s binaural hearing threshold after right cochlear implant in 10 months ago.

2 研究方法

2.1 臨床資料收集

采用項目組自主設計的問卷調查表，記錄患者病史，完成家系調查并繪制家系圖。對患者進行聽力學檢查，包括純音測聽、聲導抗、畸變產物耳聲發射（distortion product otoacoustic emissions,DPOAE），對嬰幼兒進行聽性腦干反應（auditory brainstem re‐sponse,ABR）、40Hz聽覺事件相關電位（40 Hz au‐ditory event related potential,40Hz AERP）及聽覺穩態反應（auditory steady state responses,ASSR）檢查。聽力損失程度根據500、1k、2k、4kHz平均聽閾分類，分為26-40dB HL輕度、41-55 dB HL中度、56-70 dB HL中重度、71-90 dB HL重度以及＞90 dB HL極重度聽力損失。對患者進行眼科檢查及影像學檢查，包括眼底鏡檢查、顳骨CT、內聽道MRI，評估患者眼部是否存在異常。對患者進行1-3年電話隨訪及復診，對遲發性眼部臨床表型進行長期的關注。

2.2 基因測序

采集的血樣提取基因組DNA，試劑盒由天根生物科技（北京，中國）提供。將DNA片段化及末端修復之后，構建DNA文庫。運用新一代測序技術，對其中2名患者進行目標區域測序（Targeted Regions Sequencing,TES），2名患者全外顯子測序（Whole exome sequencing,WES）。通過生物信息分析方法，確定可疑致病基因變異，先證者及其親屬均進行變異位點的Sanger驗證。

2.3 致病性分析

得到變異位點后，根據美國醫學遺傳學與基因組學會（The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG）指南將變異分為致病變異、疑似致病變異、意義不明的變異以及良性變異[6-8]。對于拷貝體變異（Copy number variations,CNVs），同樣參考ACMG指南[9]。

3 研究結果

3.1 聽力臨床表型

1707699 （圖1-A1：III.1），女，8歲，2月齡ABR檢測，雙耳氣骨導在100dB nHL均無反應；ASSR檢測，雙耳100dB nHL均無反應；40Hz AERP檢測，雙耳100 dB nHL均無反應。

1707867 （圖1-B1：II.3），女，29歲，先天性聾，右耳平均聽閾96.25dB HL，左耳平均聽閾103.75 dB HL，聲導抗正常。II.2先天性聾，右耳平均聽閾105dB HL，左耳平均聽閾107.5 dB HL。

1808120 （圖1-C1：III.3），男，3歲，7月齡ABR檢測，雙耳氣導在100dB nHL均無反應；ASSR檢測，雙耳100dB nHL均無反應；DPOAE檢測，雙耳各頻率均未引出；聲導抗顯示雙耳A型。

1908312 （圖1-D1：II.1），女，4歲，10月齡ABR檢測，雙耳氣導在95dB nHL均無反應；ASSR檢測，雙耳平均聽閾均為116dB nHL；DPOAE檢測，雙耳各頻率均未引出。患兒于10月齡右側植入人工耳蝸（cochlear implant,CI），助聽后右耳平均聽閾23.75dB HL。

四名先證者顳骨CT檢查正常，提示無內耳畸形。

3.2 基因檢測結果

家系1707699和1908312的先證者及父母進行WES檢測，家系1707867和1808120的先證者進行TES檢測，共檢測出7種PCDH15變異（NM_033056.3），2種無義變異，2種剪接位點變異，1種錯義變異，1種移碼變異，1種CNV（表1）。7種變異中，c.733C＞T為已報道的致病變異位點[2]，c.2528C＞A為已報道的意義不明的變異位點[10]，根據該家系表型及ACMG指南建議（PM2+PP1+PP3,PM表示證據強度中等，PP表示輔助證據），考慮該變異位點為疑似致病。其余均為新發現的變異。

表1 基因檢測結果及分析Table 1 Summary and analysis of genotype

對先證者父母及家族成員（12人）進行Sanger驗證，結果顯示所有親屬均為PCDH15變異單雜合攜帶者。家系1707699中，III.1為EX19-21del和c.1997+1G＞A復合變異遺傳模式，EX19-21長度約為27kb，III.2檢測結果為EX19-21 del單雜合攜帶。家系1707867中，II.3為c.3441 del A和c.2528C＞A復合雜合變異，II.1和II.2與II.3的變異位點相同。家系1808120中，II.3為c.733C＞T和c.157+1G＞A，家系1908312中，II.1為c.733C＞T和c.2756del T，均攜帶c.733C＞T這個變異位點。所有先證者均符合常染色體隱性遺傳模式。

3.3 隨訪結果

得到變異位點后，為明確患者病因，需對患者及攜帶者進行隨訪，告知有可能存在遲發性RP表型的可能性，強調視力方面檢查的重要性（表2）。

表2 先證者表型匯總Table 2 Summary of phenotype of probands

1707699 （圖1-A1：III.1）于9月齡時左側植入CI，植入后左耳平均聽閾為41.25dB HL，3歲時為31.25dB HL（圖2-B）。雙音節言語識別率為100%，語句識別為95%。患兒18月齡能獨立行走，雙眼遠視、散光，5歲時眼底鏡檢查正常（圖2-A）。III.2為EX19-21del雜合攜帶者，目前三歲，聽力正常，言語發育可。

圖2 170769眼底鏡檢查與助聽后聽閾變化。A為患者眼底鏡檢查結果（正常）；B為患者植入CI聽閾變化。Fig.2 Ophthalmofundoscopy and threshold change after CI of 170769.A:result of ophthalmofundoscopy(normal);B:threshold change after CI.

1707867 （圖1-B1：II.3），主訴無眩暈、走路不穩等前庭相關功能異常，視力在正常范圍之內。II.1和II.2臨床表型與其相同，II.1目前33歲，13歲時右側植入CI，使用兩年后效果不佳，后未再佩戴。II.2和II.3均雙側佩戴助聽器，自述交流能力一般。III代子女聽力均正常，視力在正常范圍之內，年齡10月-13歲。

1808120 （圖1-C1：III.3），11月齡左側植入CI，交流能力尚可。患兒確診為運動發育遲緩，走路和下樓梯經常性的摔倒。由于年齡限制，無法進行視網膜電圖檢查，家長拒絕進行眼底鏡檢查。

1908312 （圖1-D1：II.1），10月齡右側植入CI，交流能力尚可。18月齡獨立行走，視力雙眼遠視及散光，存在夜晚外出困難的癥狀，由于年齡限制，無法進行視網膜電圖檢查，家長拒絕進行眼底鏡檢查。

4 討論

PCDH15與鈣粘蛋白23是內耳毛細胞靜纖毛頂連接（tip-link）的重要組成部分，內耳毛細胞是一種機械-電傳感器，完成聲電轉換，幫助產生聽覺和平衡知覺[11,12]。毛細胞頂端存在靜纖毛，靜纖毛的擺動可以通過tip-link的控制打開機械門控通道[13,14]。PCDH15變異改變蛋白結構域的空間形態，機械門控通道出現異常，引起USH1F或DF‐NB23[1,2,1517]。Alagramam等在成人和胎兒視網膜及內耳內發現PCDH15的表達[1]。Ahmed等發現在人眼的感光細胞中存在PCDH15，這表明USH1患者在視力方面存在缺陷，將出現進行性RP[16]。因此，USH1臨床表型包括耳聾、前庭功能障礙和RP。

表3 在不同種族中PCDH15導致的USH1Table 3 USH1 caused by PCDH15 in different races

PCDH15變異導致的USH1是一種典型的mimics NSHL，患者在早期僅表現出耳聾特征，而RP是遲發性的。通常，患者10歲左右將會出現夜盲和隧道視覺等RP早期癥狀，隨后視野進行性向心性縮小，直至完全失明[18]。有研究發現，患者在21歲時才出現RP早期癥狀[3]。1908312已出現夜盲的癥狀，并且其與1707699均為遠視及散光。有研究表明在NSHL兒童中USH1發生率為1.3-2.2%[22]。在Vonam等的研究中，新一代測序能使USH1的診斷年齡早于視力損失的發病年齡[24]，為USH1家庭帶來許多即時和長期的幫助[17]。本研究通過基因檢測后的隨訪，3名最初診斷為NSHL的兒童，在檢測出PCDH15變異后，隨訪發現視力及前庭的異常表型。

PCDH15是導致USH1的主要致病基因，在德系猶太人中PCDH15是最常見的致病基因，c.733C＞T在該人群中存在始祖效應，占據USH1的比例為50%-60%，c.733C＞T的攜帶率為0.79%-2.48%[2,20]。在本研究中，2名患者均有c.733C＞T致病位點，考慮將其作為中國人群PCDH15熱點變異進行下一步研究。

PCDH15變異導致的USH1，除了可以通過單核苷酸變異致病，CNV同樣也是關鍵致病變異類型。CNV與遺傳性耳聾關系密切[25]。1707699外顯子19-21缺失，長度約為27kb，CNV是指大于1kb的DNA片段的缺失/重復[26]。大多數已報道的CNV集中在PCDH15前5個外顯子及第20外顯子附近，在本研究中檢測出的EX19-21 del包含在已報道的CNV范圍內（表4）。由此可見，PCDH15基因除了點變異，CNV也是的主要變異類型。

表4 PCDH15已報道的拷貝體變異Table 4 CNVs has been reported in PCDH15

PCDH15表達于毛細胞靜纖毛間的tip-link，其變異影響耳蝸的機電轉換，CI是通過手術，將電極片植入內耳，直接作用于螺旋神經節細胞，繞過耳蝸的機電轉換，進而幫助患者感知聲音[35-37]。在本次研究中，通過隨訪發現，3例兒童CI植入效果較好，1707699植入后雙音節詞言語識別率達到100%。1707867的哥哥在13周歲時才植入CI，效果不佳，佩戴兩年后未再使用。通過這些發現，PCDH15變異的耳聾患者均存在先天性重-極重度聽力損失，早期植入CI，可以讓兒童在言語發育關鍵期接受更多的聲音刺激，言語發育更好，后期兒童可以通過視力閱讀唇語，配合聽覺康復來獲得更好地言語發展[2-3,38]。

PCDH15變異是導致DFNB23和USH1的重要原因，USH1在臨床上表現為雙耳先天性重-極重度聽力損失、運動發育遲緩及進行性RP。本研究為4個極重度感音神經性聾家系明確了分子病因，發現均為PCDH15復合雜合變異，其中有7個變異位點，包括2種無義變異，2種剪接位點變異，1種錯義變異，1種移碼變異，1種CNV，5個為新發變異位點；考慮c.733C＞T為熱點變異位點，需進一步研究；通過隨訪，分析PCDH15致病患者聽力、視力、前庭功能的臨床表型，及CI佩戴效果，發現對于PCDH15基因變異導致的先天性極重度聾的患兒，在早期植入CI言語發育尚可，為PCDH15變異導致的USH1及DFNB23的分子診斷及治療干預提供參考意見，USH1作為mimics NSHL的一種，早期診斷及干預至關重要。