琥珀膽堿的法醫(yī)毒物分析研究

廖泫棟　孫世麟　路帆

摘要：目的：分析琥珀膽堿的法醫(yī)毒物檢測(cè)結(jié)果。方法：使用高效液相色譜法對(duì)2016年至2020年調(diào)查的70例氯化琥珀膽堿中毒案例進(jìn)行研究，觀察并分析案例的檢驗(yàn)結(jié)果、法醫(yī)毒物檢驗(yàn)結(jié)果、案例特征。結(jié)果：氯化琥珀膽堿中毒主要病理改變?yōu)榧毙苑斡傺?、肺水腫等猝死改變，部分死者心肌排列紊亂及斷裂。結(jié)論：氯化琥珀膽堿需要使用科學(xué)的方法進(jìn)行檢驗(yàn)。

關(guān)鍵詞：琥珀膽堿;法醫(yī)毒物;測(cè)定

前言

琥珀酰膽堿是一種骨骼肌松藥，是一種白色或接近白色、無(wú)味、含鹽的結(jié)晶粉末，它能與N2受體結(jié)合，產(chǎn)生去極化狀態(tài)，減輕骨骼肌，主要用于引起肌肉痙攣，全身麻醉后因支氣管插管、骨折脫位復(fù)位、破傷風(fēng)等急性損傷，靜脈注射后1分鐘便可見(jiàn)效。琥珀酸膽堿釋放量?jī)H為注射毒素的1%，經(jīng)琥珀酸分子與二聚膽堿脫水而硬化，使之在體內(nèi)易于被酶代謝。在日常生活中，很難找到該物質(zhì)的原型開(kāi)展檢測(cè)工作。快速、準(zhǔn)確地定性、定量分析琥珀膽堿有助于司法鑒定工作的順利進(jìn)行。

1 資料與方法

1.1臨床資料

選取70例氯化琥珀膽堿中毒案例作為研究對(duì)象，男性有38例，女性32例，年齡在20-70歲之間，平均年齡為（60±2）歲。70例受害者死后心血提取時(shí)間≤24h的有45例，提取時(shí)間在24h-36h的有25例;提取時(shí)間≥36h的有5例。

1.2研究方法

準(zhǔn)確提取死者尸體中的全血將其置入10ml的容量瓶中，加入乙腈至刻度。制備1ng/ml儲(chǔ)備溶液，冷凍至-20℃，精密吸收罐在500ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液中用乙腈依次稀釋，備用。高效液相色譜法（HPLC）以其高靈敏度、高特異、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在天然藥物成分分析、含量分析、質(zhì)量控制、穩(wěn)定性研究等方面得到廣泛應(yīng)用，已成為天然藥物有效成分的分離、分析的重要方法之一。此次應(yīng)用高效液相色譜法對(duì)70例氯化琥珀堿的尸體檢查結(jié)果、法醫(yī)學(xué)毒物檢查結(jié)果、判例特征等進(jìn)行了回顧分析，并使用SCIEX OS操作系統(tǒng)軟件研究了氯化琥珀堿中毒的檢查、鑒定的特征及規(guī)律。

2 結(jié)果

2.1尸體檢驗(yàn)結(jié)果

由表2-1可以看出，大多數(shù)死亡案例出現(xiàn)2個(gè)或更多的針孔，死者肺表面有近一半的血點(diǎn)，死者心臟表面有近3/1的血點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)多臟器淤血癥狀死者中有8.57%，7.14%死者出現(xiàn)急性肺淤血、肺水腫癥狀，5.71%的死者出現(xiàn)心肌排列紊亂、斷裂癥狀。

2.2法醫(yī)毒物檢驗(yàn)結(jié)果

由表2-2可以看出，70名死者中檢驗(yàn)出的氯化琥珀膽堿質(zhì)量濃度最低為10ng/mL以下，最高數(shù)值大于50ng/mL。其中，氯化琥珀膽堿質(zhì)量濃度在10ng/mL以下、10-20ng/mL、30-40ng/mL、40-50ng/mL、50以上ng/mL的死者所占比重分別為2.86%、45.71 %、38.57 %、11.43 %、1.43%。

2.3案例特征分析

由表2-3可知，案例中明確死亡時(shí)間和死亡時(shí)間所占比例均為一半，謀害狀態(tài)為自殺、意外、他殺的比例分別為4.29%、28.57%、67.14%，自殺和自殺人數(shù)最少，是他殺的最多。在謀害動(dòng)機(jī)中，無(wú)動(dòng)機(jī)所占比例為32.86%，在有動(dòng)機(jī)中，謀財(cái)所占比例最高，在27.14%;仇殺所占比例最低，為17.14%。

3 討論

（1）琥珀酰膽堿的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀

氯化琥珀酰膽堿（又稱 skolin，sux）是國(guó)家管制的 B類有機(jī)劇毒藥物。多用于動(dòng)物藥物或手術(shù)的麻醉誘導(dǎo)劑。注射劑無(wú)色、無(wú)色透明粘液。在臨床上主要用于氣管插管及麻醉手術(shù)時(shí)，保持肌肉放松，代謝快，半衰期2～4 min。如用藥過(guò)度或不使用呼吸機(jī)，肌纖維去極化時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的鉀離子迅速流出，引起高血鉀、重度室性心率異常和心臟驟停。心動(dòng)松弛可能是醋酸膽堿引起的。結(jié)節(jié)律性心率異常，心臟緊急停止。大劑量的琥珀酰胺膽堿有抗神經(jīng)節(jié)作用，組胺物質(zhì)明顯釋放，導(dǎo)致支氣管痙攣、血壓降低和過(guò)敏性休克，有可能導(dǎo)致呼吸筋麻痹和心室死亡。氯化琥珀膽堿中毒死亡多發(fā)生于中毒后10分鐘內(nèi)，因氯化琥珀膽堿的藥效特性而引起的。氯化琥珀酰膽堿在水中具有很強(qiáng)的可溶性。它是一種快速的肌肉松弛藥。肌松效應(yīng)始于60～90 s，持續(xù)時(shí)間約10 min，大劑量可引起心率減慢、心律失常、早搏、支氣管痙攣或組胺釋放性休克。目前，罪犯?jìng)冇寐然牾０纺憠A投擲保鏢和弩來(lái)?yè)尳偕螅糜趽尳贇⑷?。因?yàn)闆](méi)有明顯的中毒跡象，毒販很難直接懷疑中毒。但是，不像傳統(tǒng)的毒藥（毒性強(qiáng)），飛鏢注射器的液體暴露在空氣中后迅速蒸發(fā)成白色粉末，上述物理化學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特性，如：氯化琥珀酰膽堿，一般的物理和化學(xué)測(cè)試，如死者的血液，肝組織和胃內(nèi)容物只能在小便中檢測(cè)出來(lái)。魷魚(yú)水解酶丁酰失去膽堿酯酶活性，從理論方面來(lái)看，可將物質(zhì)置于血液中。

（2）琥珀酰膽堿的檢測(cè)方法

隨著社會(huì)的發(fā)展和人民生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越重視藥品的質(zhì)量和安全性。需要一種快速可靠的分析方法，以確保出口和出口到國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的氯化琥珀的安全。琥珀膽堿進(jìn)入人體后會(huì)很快被清除，對(duì)法醫(yī)毒理學(xué)分析的靈敏度和準(zhǔn)確性有更高的要求。同時(shí)，藥物的季銨鹽結(jié)構(gòu)具有較大的極性，這給生物樣品的預(yù)處理和分離分析帶來(lái)了重大挑戰(zhàn)。第一個(gè)放射性標(biāo)記琥珀膽堿被用來(lái)研究其體內(nèi)的過(guò)程，隨后是薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法作為定性和定量分析工具。生物樣品中的琥珀膽堿。這些色譜法中常見(jiàn)的問(wèn)題是檢測(cè)靈敏度低，最小定量限制在100-200 ng/mL左右?；蛘?，在分析過(guò)程中采用色譜柱后，形成過(guò)氧化膽堿和間接測(cè)量體液中琥珀膽堿的反應(yīng)非常復(fù)雜。目前經(jīng)常使用氣相色譜-質(zhì)譜法、液相色譜法對(duì)生物樣品中的琥珀膽堿進(jìn)行分析。

金培海等使用溴化鉀壓片法在紅外線光譜儀中毒事件中被檢測(cè)出，或發(fā)現(xiàn)犯罪道具中殘留的可疑藥物。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)與紅外光譜庫(kù)（Georgia State Forence Drugs）相比，相應(yīng)的氯化琥珀膽堿比與樣品和光譜庫(kù)中的氯化琥珀膽堿標(biāo)準(zhǔn)紅外光譜圖的吸收峰值特征一致。此外，與檢材的標(biāo)準(zhǔn)比中，樣品的匹配率可以達(dá)到（98.93%）。因此，應(yīng)用紅外光譜學(xué)，定性檢查氯化琥珀膽堿具有準(zhǔn)確可靠的特征，可以用于高純度氯化琥珀的膽堿的定性檢查。張姮婕等通過(guò)抑制電導(dǎo)率檢測(cè)器（4 mm×250 mm），以甲烷磺酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min-1，通過(guò)抑制電導(dǎo)率檢測(cè)器（4 mm×250 mm），以抑制電導(dǎo)率計(jì)（r=0.999）和14.4～449.8 ng/mL （r=0.999）內(nèi)線關(guān)系良好，定量限制均為0.01。氯化膽堿、氯化琥珀酰胺單膽堿回收率分別為103.4%～105.7%、102.4%～107.1%。氯化膽堿、氯化琥珀酰胺注射液?jiǎn)螇A回收率分別為95.6%～100.2%，94.4%～103.5%。王香溢等采用UHPLC-HRMS串聯(lián)串聯(lián)高分辨率質(zhì)譜儀（UHPLC-HRMS）方法，利用 LunaNH 2色譜柱（2 mm×100 mm，3μ m），以0.1%的甲酸水溶液-乙腈等度洗脫，流速是0.2 mL·min，進(jìn)樣體積為5μ m。在大鼠皮膚注射部位可檢測(cè)到氯化琥珀膽堿，其含量隨劑量增加而增大。王學(xué)虎等在9只動(dòng)物身上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采集動(dòng)物死亡后的血液和心臟血，優(yōu)化氣相色譜-質(zhì)譜條件和注射順序，有效分離空白干擾物和代謝物。他們首先對(duì)中毒死亡試驗(yàn)中的琥珀酰單膽堿進(jìn)行了估算，并分析了琥珀酰單膽堿與琥珀酰單膽堿的比值，以便從實(shí)際情況估算琥珀酰膽堿的來(lái)源，并將琥珀酰膽堿納入中毒毒理學(xué)試驗(yàn)的目標(biāo)。琥珀酰膽堿提高了陽(yáng)性生物檢測(cè)材料的陽(yáng)性檢出率。潘衛(wèi)剛等使用UHPLC串聯(lián)四極桿時(shí)間高分辨質(zhì)譜技術(shù)能快速檢測(cè)和鑒定毒素。該實(shí)驗(yàn)以凡丹、敵敵畏 AAA、百草枯病和琥珀氯化物為例，用液-液萃取，經(jīng) SPE柱凈化反應(yīng)，再用 IDA掃描。利用高分辨單離子法，學(xué)者們從禽膽肝中定量 Frandan，檢測(cè)魚(yú)塘中敵敵畏，并檢測(cè)南瓜葉上的南瓜葉。濃度范圍從0.5到500出現(xiàn)4種有毒物質(zhì)。在0.5μ g/kg范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999或更高，測(cè)量?jī)x器（s/N=3）的測(cè)量限為0.2。研究結(jié)果表明：樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～5.4%之間（n=6），樣品的回收率為73.4%～98.9%。該法簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏，可滿足法醫(yī)毒素快速檢測(cè)與鑒定的需求。劉縉等在醋酸鹽溶液和白沉降堿中加入“毒鏢”，利用紅外光譜對(duì)白沉降進(jìn)行定性分析，通過(guò)氣相色譜-質(zhì)譜-醋酸酯成分分析。結(jié)果表明，該方法能快速檢測(cè)琥珀膽堿和普魯卡因的組分，與81.3%紅外光譜相似。盛潔等向大鼠皮下注射三劑吸液。4小時(shí)后，盛杰等提取大鼠皮膚和器官組織進(jìn)行乙腈蛋白沉淀和固相，提取WCX進(jìn)行純化。流動(dòng)相為0.1%酸性溶液乙腈等的洗脫液。采用正離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）進(jìn)行質(zhì)量分析。吸入離子對(duì)（M/z145.1在壓縮、壓縮、壓縮、壓縮、壓縮離子對(duì)（M/z145.1）領(lǐng)域）結(jié)果suc的檢測(cè)值為0.01，L的回收率為89，5%～95.4%，平均日回收率小于15%。在NS對(duì)照組的基礎(chǔ)上，在三個(gè)劑量的蔗糖組中檢測(cè)了血清和主要器官組織如心臟、肝臟和腎臟的蔗糖，結(jié)果令人滿意結(jié)果表明，吸力在大鼠心臟、肝臟、腎臟等重要器官均有表達(dá)，MS/MS法是測(cè)定大鼠體內(nèi)毒性藥物水平的可靠方法。

（3）琥珀酰膽堿的檢測(cè)結(jié)果

全血中的琥珀膽堿首先由丁酰膽堿酯酶迅速代謝成琥珀單酰膽堿，并在此酶作用下繼續(xù)代謝琥珀酸和膽堿，后者代謝速度比前者慢。琥珀酸和膽堿都是人體內(nèi)的內(nèi)源性成分，其特異性不強(qiáng)，由于琥珀單酰膽堿代謝緩慢，可作為檢測(cè)琥珀膽堿中較好的表征成分。由于琥珀膽堿進(jìn)入人體后很快就被清除，因此對(duì)法醫(yī)毒物分析的靈敏度和準(zhǔn)確性提出了更高的要求。與此同時(shí)，藥物的季銨鹽結(jié)構(gòu)有很大的極性，這給生物樣品的預(yù)處理和分離分析帶來(lái)了挑戰(zhàn)。分析對(duì)象選用琥珀膽堿原型藥及琥珀單酰膽堿類化合物，嘗試用親水色譜柱代替反相色譜柱，進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，減少內(nèi)源性干擾對(duì)定量的影響，提高檢測(cè)靈敏度，縮短分析時(shí)間。

氯化琥珀膽堿中毒的征兆是死亡速度快，死亡率高，且多為重尸斑、面部青紫、心肺表面出血點(diǎn)等癥狀，與不治性猝死、室息死亡等類似。更重要的是一般針孔較小，不易發(fā)現(xiàn)，容易漏檢。因此這類案件的隱蔽性很強(qiáng)，容易誤檢為疾病猝死或毒物中毒死亡。對(duì)懷疑的琥珀膽堿中毒對(duì)象，越早取樣品中檢出琥珀膽堿和琥珀單酰膽堿的含量越高，偵破案件就越有利。對(duì)于從這類案件中提取的生物檢材，添加酶抑制劑和防腐劑的冷凍保存可最大程度地保護(hù)藥物原型及其代謝物不受酶或微生物影響。對(duì)猝死明顯、疾病或一般毒物未檢見(jiàn)且死亡原因不明的案例，務(wù)必再仔細(xì)檢查尸檢，特別是檢查尸表是否有注射針眼，尤其是在頭發(fā)、腋窩、陰阜等隱蔽部位，以氯化琥珀膽堿為常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)，防止此類案件的漏檢。

本文使用高效液相色譜法對(duì)患者體內(nèi)的氯化琥珀膽堿進(jìn)行法醫(yī)毒物分析，發(fā)現(xiàn)該方法可以監(jiān)測(cè)到不同濃度的氯化琥珀膽堿，觀測(cè)到死者的傷痕，推斷出死者的死亡時(shí)間，具有較高的檢測(cè)質(zhì)量，值得被廣泛應(yīng)用與推廣。

參考文獻(xiàn)

[1]李晨華，王賓，王藝璇.紅外光譜和液質(zhì)聯(lián)用儀檢驗(yàn)生物檢材中的氯化琥珀膽堿[J].廣東公安科技，2021，29（02）：22-24.