生活飲用水水樣保存與運輸條件對菌落總數檢測的影響

張艷芬，李紅巖，鄭 蓓，于志勇，李 潔

(中國科學院生態環境研究中心，中國科學院飲用水科學與技術重點實驗室，北京 100085)

飲用水微生物污染對人體健康造成威脅，在所有飲用水安全的影響因素中居于首位[1]，通過微生物指標的檢測控制水質污染是飲用水水質安全保障的重要部分[2]，而水樣的采集與運輸是確保微生物指標檢測結果能夠客觀、真實反映水中微生物水平的關鍵步驟[3-4]。

為保障檢測數據的準確性及可靠性，《生活飲用水標準檢驗方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006)(以下簡稱《標準方法》)中規定，用于微生物分析的水樣保存方法為低溫(0～4 ℃)避光保存，保存時間為4 h[5]。《水質采樣 水樣的保存和管理技術規定》(HJ 493—2009)也規定了用于微生物分析的水樣保存方法為2～5 ℃冷藏，盡快檢測[6]。然而，實際生產活動中，由于檢測實驗室與采樣地點的距離限制，水樣采集后運輸時長往往超過4 h，無法滿足《標準方法》要求。長距離的運輸和不適宜的保存溫度可能導致微生物代謝活性、生長速率和繁殖狀態發生改變[7]，從而導致水中微生物指標的檢測結果不能反映真實水質。歐盟《水質——微生物分析的抽樣》(ISO 19458∶2006)中推薦，用于微生物指標檢測的水樣在(5±3)℃下保存8 h，最大可接受時長為12 h[8]。世界衛生組織(WHO)《飲用水水質準則》(第二版)指出，使用冷藏運輸箱運輸的情況下，水樣采集與檢測的時間間隔不超過6 h，最長時長不應超過24 h[9]。美國《飲用水樣本采集快速指南》建議低于10 ℃以下冷藏，不超過30 h[10]。因此，探索并明確適用于飲用水微生物指標檢測的水樣保存條件，對指導飲用水微生物指標在實際生產活動中的檢測具有重要的實用價值。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料和設備

生化培養箱(哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司，HPS-280)，營養瓊脂(陸橋，北京)，菌落總數質控樣(愛德士，美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 保存溫度和時長對菌落總數的影響試驗

400 mL龍頭水中添加1支菌落總數質控樣(愛德士，美國，批號：031318-1)作為測試水樣。水樣均分4份，分別于4、15、25 ℃和36 ℃條件下保存。按照《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)中的平皿計數法分別對水樣保存0、4、8、12 h和24 h的菌落進行總數測定(樣品數n=5)[13]。使用的龍頭水總氯含量為0.38 mg/L，在添加質控樣前的菌落總數為(2±0.71)CFU/mL (n=5)。水樣均分為4份時，根據《標準方法》要求，每100 mL添加0.8 mg硫代硫酸鈉以去除氯消毒劑的影響。

1.2.2 實際水樣分析試驗

在2019年6月—9月，隨機選取北京市轄區內的出廠水、管網水以及鄉鎮井水為研究對象，分不同批次進行水樣采集。采樣地點距檢測實驗室最遠距離約79 km，最近距離約3 km，水樣采集后盡快運回實驗室。每個采樣點采集2份水樣，每份水樣5個平行，水樣運輸模式為冷鏈運輸(記錄冷藏運輸箱溫度)和同車常溫運輸(記錄車內溫度)，水樣到達實驗室后立即按照《生活飲用水標準檢驗方法 微生物指標》(GB/T 5750.12—2006)進行菌落總數檢測，保存時長的統計原則為采樣開始后至檢測開始前。

1.2.3 統計分析

本文所有統計分析使用PASW Statistics 18軟件。不同保存時長后菌落總數結果與0時刻結果的差異顯著性使用獨立樣本T檢驗分析，不同溫度條件下菌落總數結果的差異顯著性使用單因素方差分析，溫度和時長雙因素的主體間效應使用雙因素方差分析。實際水樣分析時，不同運輸條件下菌落總數結果的差異顯著性使用獨立樣本T檢驗分析。

2 結果和討論

2.1 保存溫度和時長對菌落總數的影響

2.1.1 不同保存溫度和時長條件下的菌落總數結果

本文給出了一種基于能量均衡樹的無線傳感器網絡實現方案，實現了低實施成本、低維護量、高自動化的數據遠程監測。利用無線傳感器網絡的分布式特點，大幅度提高了系統在移動性、便捷性、組網靈活性等方面的綜合功能，在各個領域的應用會有很好的發展前景。

不同保存溫度和時長條件下的菌落總數結果如表1所示。所有水樣在0時刻的菌落總數結果相近，均值在(81±4)～(85±4)CFU/mL。保存4 h后，各溫度條件下的菌落總數與初始值相近。8 h和12 h后，4～25 ℃保存條件下的菌落總數依然與初始值相近，在(75±2)～(88±5)CFU/mL，36 ℃保存條件下的菌落總數則分別增加至(103±4)CFU/mL和(134±8)CFU/mL。24 h后，4 ℃和15 ℃條件下的菌落總數依然保持在(75±4)CFU/mL和(89±3)CFU/mL，接近初始值，而25 ℃和36 ℃條件下的菌落總數與初始值相比已分別增長約11倍和137倍。

表1 不同保存溫度和時長條件下的菌落總數 (平均值±標準誤，n=5)Tab.1 Total Count of Bacteria Colonies under Different Preservation Temperatures and Time (Mean±Standard Error,n=5)

2.1.2 保存時長和溫度影響的差異顯著性分析

保存時長和保存溫度對菌落總數結果影響的差異顯著性分別如圖1和圖2所示。由圖1可知，在4 ℃和15 ℃低溫條件下，水樣保存24 h內的菌落總數結果均與0 h的初始結果無顯著差異(P>0.05)；圖2的結果同樣表明，不同保存時長下，15 ℃的結果均與4 ℃無顯著差異(P>0.05)，這表明15 ℃和4 ℃均可以在24 h內維持飲用水水樣中的菌落總數在初始采集時的狀態。

在25 ℃條件下，12 h內的菌落總數結果與0 h無顯著差異(P>0.05)，而保存24 h后菌落總數增加了1個數量級，與0 h存在顯著差異(P<0.05，圖1)；不同時長下溫度影響的差異顯著性分析結果(圖2)也表明，25 ℃僅在保存時長為24 h時顯著高于4 ℃和15 ℃的結果(P<0.05)。以上結果表明在25 ℃室溫條件下飲用水中的細菌可進行緩慢的繁殖代謝[14-15]，24 h后在數量上表現出明顯的增加。

注：每組內，不同字母表示不同溫度處理之間存在顯著差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)；即在組內，a與b、b與c、a與c之間存在顯著差異，a與ab、ab與b之間不存在顯著差異圖2 不同保存溫度條件下的菌落總數Fig.2 Total Counts of Bacteria Colonies under Different Preservation Temperatures

在36 ℃條件下，保存4 h后的檢測結果與0 h的結果相比無顯著差異(P>0.05)，但保存8 h后的檢測結果顯著高于0 h(P<0.05)，12 h和24 h后測定的結果均與0 h結果存在極顯著差異(P<0.01和P<0.001)。不同時長下溫度影響的差異顯著性分析也表明，8、12 h和24 h時，36 ℃的結果均顯著高于4 ℃和15 ℃的結果(P<0.05，圖2)。這說明水中的細菌在36 ℃條件下保存時，8 h內已進行繁殖[16]，在數量上顯著高于采集時的初始狀態。

2.1.3 主體間效應檢驗

雙因素方差分析的結果如表2所示，溫度、時長以及溫度和時長對菌落總數的P均為0.000，小于0.05。這一結果表明，在給定顯著水平0.05基礎上，溫度和時長作為單因素均對菌落總數的測定有顯著影響，同時，保存溫度與時長的交互作用對菌落總數測定結果的影響也是顯著的。溫度與時長交互作用的顯著性影響表明，溫度與時長對菌落總數測定的影響相互依賴。

表2 影響因素的主體間效應檢驗Tab.2 Effect Tests of Inter-Subjective Influencing Factors

熱圖作為一種常見的可視化方式，可直觀呈現數據之間的差異性。如圖3所示，高溫與長時間保存的共同作用導致菌落總數與初始狀態的顯著差異，而高溫短時、低溫長時的保存對測定結果均無顯著影響，因此，溫度和時長的交互作用是水樣保存條件中不可忽略的因素。

在溫度、時長、溫度與時長的交互作用3個影響因素之間，根據F的大小(表2)，溫度與時長的交互作用對菌落總數的影響小于溫度，而溫度的影響小于時長。綜上，在影響微生物指標測定的水樣保存條件中，時長是最重要的影響因素，溫度以及溫度與時長的交互作用次之。

注：*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001圖3 水樣不同保存條件下菌落總數的熱圖分析Fig.3 Heatmap Analysis of Total Counts of Bacteria Colonies of Water Samples under Different Preservation Conditions

2.2 實際水樣分析

實際生產中，尤其長距離采集水樣時，由于運輸距離和天氣條件影響，水樣采集后往往無法滿足4 h內實驗室檢測的要求。本文調查了夏季時不同運輸距離的16個樣點采樣后的保存和運輸條件對水樣檢測的影響，檢測結果如表3所示，所有水樣均為5次平行測定結果。

由表3可知，保存時間小于4 h的出廠水樣和管網水樣中，冷鏈運輸與同車常溫運輸條件下P大于0.05，即差異不顯著。保存時間在4～8 h的10個水樣，其中8個水樣冷鏈運輸與同車常溫運輸條件下所獲得數據差異不顯著。其中，水樣在(35.13±2.61)℃下保存4.23 h后的檢測結果顯著高于冷藏保存條件，水樣在(32.31 ±1.51)℃下保存7.85 h后的檢測結果顯著高于冷藏保存條件，而保存時長超過8 h的水樣，其在(31.89±0.54)℃下的結果也顯著高于冷藏條件，即當保存時長超過4 h時，31～36 ℃的高溫條件存在導致微生物指標發生顯著改變的風險。

表3 實際水樣驗證試驗 (平均值±標準誤，n=5)Tab.3 Verification Experiments for Actual Drinking Water Samples (Mean±Standard Error,n=5)

上述結果表明：保存時長小于4 h的水樣，運輸溫度無顯著影響；保存時長在4～8 h的水樣，建議冷鏈運輸或在25 ℃以下的環境溫度下保存。這與通過龍頭水添加質控樣的保存溫度和時長對菌落總數影響試驗的結果一致。

3 結論

本文以菌落總數的檢測為例，綜合研究了生活飲用水水樣保存溫度和保存時長對微生物指標檢測的影響，主要結論如下。

(1)生活飲用水水樣保存溫度、時長均對微生物指標測定有顯著影響，且兩者的影響相互依賴，其中時長是最重要的影響因素。

(2)建議根據運輸時長選擇合適的保存溫度：在4 h內檢測的生活飲用水水樣可于環境溫度下保存；在12 h內檢測的生活飲用水水樣需保存在4～25 ℃條件下；超過12 h檢測的生活飲用水水樣需冷藏于4～15 ℃，最長可保存24 h。