大腸埃希氏菌熒光定量PCR法與酶底物法相關性分析

路曉鋒，吳 凡

(廣東粵港供水有限公司，廣東深圳 518001)

大腸埃希氏菌，屬于革蘭氏陰性短桿菌，鞭毛周生，能運動，無芽孢，兼性厭氧生長，是人體和其他動物腸道中的正常寄居細菌[1-2]。但當人體機體免疫功能降低時，這類細菌會表現出對人體的致病性，通常表現為腹瀉、腸炎等癥狀，因此，大腸埃希氏菌也被歸類為條件致病菌[3-5]。在水質檢測領域，國內外水質標準中通常把大腸埃希氏菌作為水體受糞便污染的檢測指標。

國內《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750—2006)中對大腸埃希氏菌的檢測方法包括多管發酵法、濾膜法和酶底物法，其中酶底物法檢測步驟最簡單，僅需在水樣中加入MMO-MUG培養基進行24 h培養后即可得到大腸埃希氏菌的結果，目前已逐漸被廣泛采用。但檢測結果需要1 d，具有一定的滯后性，不能滿足水樣應急檢測的需求。熒光定量PCR法通過提取大腸埃希氏菌的基因，利用設計好的大腸埃希氏菌靶標基因引物進行基因擴增，以儀器讀取的熒光強度計算出基因的拷貝數，整個操作僅需1～2 h，且能對多個樣品進行同步檢測，適合大批量的試驗操作。樓秋雯等[6]進行相關的方法研究，使用熒光定量PCR中的染料法對大腸埃希氏菌靶標基因進行定量檢測。由于染料法使用SYBR Green Ⅰ對雙鏈DNA結合后的熒光信號值進行檢測判斷，同時對非特異擴增的熒光信號也會進行讀取，容易造成檢測結果的誤差。因此，本試驗使用探針法檢測大腸埃希氏菌靶標基因，提高檢測的特異性。對大腸埃希氏菌不同檢測方法的比較，陳樑[7]將熒光定量PCR法和濾膜法的檢測結果進行比較分析，發現兩種方法的相關性較強。但大多數研究使用定性的結果進行比較，沒有進行定量，且目前針對水體中大腸埃希氏菌的熒光定量PCR法與酶底物法檢測結果的相關性研究仍較少，能否把熒光定量PCR法作為酶底物法的補充方法仍缺乏相關的數據支撐。

通過前期的試驗，建立了針對大腸埃希氏菌靶標基因gus的熒光定量PCR法，方法靈敏度高、檢測時間短，能批量進行樣品檢測。在前期研究的基礎上，進一步比較分析熒光定量PCR法和酶底物法的相關性，為熒光定量PCR法能實際應用于水體中大腸埃希氏菌的檢測提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 設備和耗材

熒光定量PCR儀(美國伯樂)；恒溫培養箱(上海一恒)；移液槍(德國艾本德)；高壓蒸汽滅菌器(雅馬拓)；生物安全柜(蘇凈安泰)；程控定量封口機(美國愛德士)；97孔定量盤(美國愛德士)；8連PCR管(美國伯樂)；純水機(密理博)；水浴鍋(常州朗越)；核酸分光光度計(美國賽默飛)；接種環。

1.2 菌種和試劑

大腸埃希氏菌(CMCC 44102，中國醫學細菌菌種保藏管理中心)；酶底物法試劑盒(美國愛德士)；麥氏比濁管試劑盒(廣東環凱)；營養肉湯培養基(廣東環凱)；2×itaq Mix試劑盒(美國伯樂)；大腸埃希氏菌質粒DNA標準菌株(上海生工)；質粒DNA小量抽提試劑盒(北京天根)；引物和探針(上海生工)，堿基序列如表1所示。

表1 大腸埃希氏菌熒光定量PCR檢測用引物和探針序列Tab.1 Primers and Fluorogenic Probes for Detection of Escherichia coli

1.3 樣品檢測

1.3.1 樣品制備與采集

(1)標準菌株模擬配水樣品

制備不同濃度梯度的大腸埃希氏菌模擬水樣樣品。對干粉菌株進行復蘇后傳代培養，第三代的培養物作為試驗用菌株。使用接種環挑取培養后的菌落接種于肉湯培養基，經培養把肉湯培養物添加到1號麥氏比濁標準管內，對照標準管的細菌濃度使用0.9%滅菌的生理鹽水進行稀釋，麥氏比濁的標準對照如表2所示。以系列稀釋方式制備1、10、50、100、500、1 000、1 500、2 000 CFU/(100 mL)的大腸埃希氏菌系列樣品，每個梯度樣品各200 mL。對梯度樣品分別使用酶底物法和熒光定量PCR法進行操作，兩種方法使用的樣品量均為100 mL。

表2 麥氏比濁標準對照Tab.2 McFarland Standards Control

(2)采集實際水樣樣品

采集不同來源的水源水各300 mL，分別使用100 mL水樣進行熒光定量PCR法和酶底物法的比對試驗，編號分別為1#水源水、2#水源水和3#水源水。同時，同步采集不同的出廠水(1#出廠水、2#出廠水和3#出廠水)各300 mL和不同的管網水(1#管網水、2#管網水和3#管網水)各300 mL進行兩種方法的比對試驗，每種方法使用水樣各100 mL，并分別在90 mL的3#水源水、3#出廠水和3#管網水中加入10 mL濃度為5 000 CFU/(100 mL)標準菌株，編號分別為4#含標準菌株水源水、4#含標準菌株出廠水和4#含標準菌株管網水。

1.3.2 酶底物法檢測大腸埃希氏菌

參照《生活飲用水標準檢驗方法》(GB/T 5750.12—2006)4.3節中酶底物法操作進行。

1.3.3 熒光定量PCR法檢測大腸埃希氏菌

使用質粒DNA小量抽提試劑盒對含標準品的質粒菌株提取質粒DNA，用于構建標準品的標準曲線，取10 μL液體作為檢測用的標準品DNA模板。使用快速法提取水樣樣品的DNA。對樣品進行離心，10 000 r/min離心10 min，留取下層液體約5 mL，充分混勻后分次轉移到1.5 mL同一離心管中，7 500 r/min離心5 min收集菌體沉淀物，在沉淀物中加入10 μL的無菌水，充分混勻，100 ℃水浴10 min，水浴結束后12 000 r/min離心10 min，吸取上清液約10 μL作為檢測用的DNA模板，-20 ℃保存備用。

配置標準品拷貝數濃度梯度，對提取的質粒DNA使用核酸分光光度計進行質粒的濃度測定，核酸分光光度計在檢測前需使用滅菌的去離子水進行調零。測定的質粒濃度經換算公式得出標準品的拷貝數，使用無菌水進行10倍的逐級稀釋，制備成107、106、105、104、103、102、101Copies/μL這7個標準濃度，用于建立熒光定量PCR法的標準曲線。

配置熒光定量PCR反應體系，具體含量如下：10 μmol/L的上游引物2.5 μL，10 μmol/L的下游引物2.5 μL，10 μmol/L的探針2.5 μL，2×itaq Mix試劑12.5 μL，DNA模板2 μL，無菌水補充至25 μL。反應體系設置陽性對照和陰性對照，其中，陽性對照使用拷貝數為102Copies/μL的標準品，陰性對照使用無菌水。

熒光定量PCR擴增程序，95 ℃預變性5 min，95 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，變性與延伸步驟循環40次，延伸階段讀取熒光信號，熒光通道選擇6-羧基熒光素(FAM)模式。

2 結果和討論

2.1 酶底物法檢測

對大腸埃希氏菌系列濃度梯度標準水樣和實際水樣進行酶底物法檢測，使用愛德士酶底物法檢測試劑盒，每個樣品使用量為100 mL，培養結束后使用366 nm紫外光光源照射，大腸埃希氏菌在光源下會顯示熒光，統計97孔定量盤中發出熒光的孔數，對照MPN表得出檢測結果，如表3～表5所示。

表3 大腸埃希氏菌酶底物法標準水樣檢測結果Tab.3 Detection Results of Escherichia coli by Enzyme Substrate Technique for Standard Water Samples

由表3可知，酶底物法檢測結果與比濁法測定的樣品濃度接近，相關系數r=0.99，表明酶底物法能較真實地反映濃度梯度范圍內的樣品濃度。表4和表5是使用酶底物法應用于水源水、出廠水和管網水的檢測結果，水源水、含標準菌株水源水、含標準菌株出廠水和含標準菌株管網水結果顯示，酶底物法能有效檢出含有大腸埃希氏菌的實際水樣，且檢測結果與含標準菌株水樣的理論濃度接近，可作為與熒光定量PCR法方法比對的可靠方法。

表4 大腸埃希氏菌酶底物法實際水樣檢測結果Tab.4 Detection Results of Escherichia coli by Enzyme Substrate Technique for Water Samples

表5 含標準菌株水樣檢測結果Tab.5 Detection Results of Water Samples Containing Standard Strains

2.2 熒光定量PCR法檢測

2.2.1 建立標準品質粒的標準曲線

使用質粒DNA小量抽提試劑盒對質粒DNA進行抽提，按照試劑盒說明書進行操作，最后使用10 μL無菌水洗脫質粒，對抽提的質粒DNA使用核酸分光光度計進行濃度檢測，質量濃度為40 ng/μL，計算出標準品的拷貝數為2.01×1010Copies/μL，具體計算如式(1)[8]。對初始標準品使用無菌水稀釋后配置成系列濃度標準品，先取5 μL拷貝數約為2.01×1010Copies/μL的初始標準品與5 μL無菌水混勻，此時標準品拷貝數約為1010Copies/μL，再取10 μL拷貝數約為1010Copies/μL的標準品與90 μL無菌水混勻制備成拷貝數約為109Copies/μL的標準品。以相同10倍逐漸稀釋的方式制備成約107、106、105、104、103、102、101Copies/μL的系列標準品用于制備標準曲線，繪制成的標準曲線用于樣品的定量，以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以儀器測定的熒光信號到達閾值時的循環數(cycle threshold,Ct值)為縱坐標，其中Ct值即PCR擴增反應的次數，當樣品的初始拷貝數越高，所需要的反應次數越少，標準曲線如圖1所示。濃度梯度質粒的擴增曲線如圖2所示，橫坐標為Ct值，圖上表示從基線到指數增長的拐點所對應的循環數，即擴增曲線與水平基線相交點所對應的橫坐標的值；縱坐標為相對熒光單位(relative fluorescence units,RFU)，表示經PCR反應后的信號強度，即被擴增的產物量。

圖1 大腸埃希氏菌熒光定量PCR標準曲線Fig.1 Standard Curve Recorded with the Real-Time PCR for Escherichia coli Detection

圖2 大腸埃希氏菌熒光定量PCR擴增曲線Fig.2 Amplification Curves Recorded with the Real-Time PCR for Escherichia coli Detection

(1)

其中：Cn——標準品拷貝數，Copies/μL，即每μL中大腸埃希氏菌gus基因的個數；

NA——阿伏加德羅常數，6.02×1023Copies/mol，即1 mol的拷貝數為6.02×1023Copies；

C——質粒濃度，ng/μL，取40 ng/μL；

L——大腸埃希氏菌gus基因長度，1 811 堿基數(bp)，bp代表基因的長度；

660——每個堿基的物質的摩爾質量，g/(mol·bp)。

圖1的標準曲線方程為Ct=-3.368 6x+39.041，相關系數r=0.999，擴增效率為98.1%，擴增效率表示PCR反應對擴增樣品的效率，理論上PCR反應為指數增長，即反應n次，對應的擴增產物增長為原來的2n，擴增效率計算如式(2)[9]。不同擴增曲線間的間隔明顯，可滿足標準曲線用于大腸埃希氏菌樣品的定量檢測。

(2)

其中：E——擴增效率，一般在90%～110%；

k——標準曲線方程的斜率。

2.2.2 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法檢測

對大腸埃希氏菌系列濃度標準水樣和實際水樣進行定量分析，每個樣品進行3次平行試驗，通過檢測的Ct值代入標準曲線的公式，計算得出拷貝數濃度，最后經體積換算出100 mL樣品的大腸埃希氏菌靶標基因的拷貝數。具體檢測結果如表6和表7所示。

表6 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法標準水樣檢測結果Tab.6 Detection Results of Escherichia coli by Fluorescence Quantitative PCR for Standard Water Samples

表7 大腸埃希氏菌熒光定量PCR法實際水樣檢測結果Tab.7 Detection Results of Escherichia coli by Fluorescence Quantitative PCR for Water Samples

大腸埃希氏菌熒光定量PCR檢測結果與比濁法檢測的菌液濃度無顯著性差異，兩者相關系數r=0.99，陰性對照與陽性對照結果準確，表明用于大腸埃希氏菌靶標基因gus的熒光定量PCR法能真實反映濃度梯度范圍內的樣品濃度。從實際水樣的檢測結果分析，熒光定量PCR法對含標菌的不同類型水樣及水源水均能檢出，且含標菌樣品檢測結果與標準菌株濃度相接近，表明熒光定量PCR法對實際水樣的檢測結果可靠。濃度梯度的標準水樣樣品和實際水樣樣品平行樣品間的相對標準偏差分別在3%～16%和8%～16%，檢測方法的精密度較好，能滿足對大腸埃希氏菌的檢測要求。對于濃度在1～10 CFU/(100 mL)的樣品，熒光定量PCR法不能進行檢測，所有檢測結果均為未檢出，方法適合應用于50 CFU/(100 mL)及以上的樣品的定量檢測。

2.2.3 熒光定量PCR法與酶底物法相關性分析

將熒光定量PCR法與酶底物法的檢測結果進行相關性線性回歸分析，結果如圖3所示。

圖3 熒光定量PCR法與酶底物法線性回歸圖Fig.3 Linear Regression between Fluorescence Quantitative PCR and Enzyme Substrate Technique

由圖3可知，兩種方法的相關性系數r=0.99，表明兩種方法的相關性較好。如表8所示，將兩種方法的檢測結果進行統計學分析，使用配對t檢驗方法進行結果評價，分析結果表明，P=0.58>0.05，配對t檢驗結果的絕對值|t|=0.56，小于t雙尾臨界值，表示兩組數據在α=0.05的置信水平上無差異。綜上，熒光定量PCR法能作為酶底物法的有效補充方法。

表8 熒光定量PCR法與酶底物法統計學分析Tab.8 Statistical Analysis between Fluorescence Quantitative PCR and Enzyme Substrate Technique

劉渠等[10]使用總大腸菌群β-半乳糖苷酶編碼基因lacZ作為靶標基因建立熒光定量PCR法，并與多管發酵法進行相關性分析，結果表明含量為100 CFU/(100 mL)水平以上的總大腸菌群樣品，兩種檢測方法的相關性較高，相關性系數r=0.99。劉永軍等[11]使用通用引物熒光定量PCR法對5個地表水體的病原性腸桿菌進行檢測，并與濾膜法檢測的總大腸菌群、菌落總數與糞大腸菌群的計數結果進行相關性分析，結果顯示熒光定量PCR結果與總大腸菌群、菌落總數與糞大腸菌群的濾膜法計數結果均呈顯著性正相關，相關系數r分別為0.983、0.908、0.948。本研究對含量為50 CFU/(100 mL)的大腸埃希氏菌樣品建立熒光定量PCR法與酶底物法的相關性分析，結果表明在此濃度上的相關系數r=0.99，相比使用lacZ基因的總大腸菌群熒光定量PCR檢測結果，試驗在更低細菌含量水平上達到較好的相關性，表明方法的靈敏度比以往的研究方法高。同時，使用針對β-葡萄糖醛酸酶編碼基因gus進行大腸埃希氏菌熒光定量PCR法檢測，比使用通用引物對大腸菌群進行檢測的相關系數更高，表明使用專一性引物比通用引物具有更高的準確性。

在實際水質檢測中，對于大腸埃希氏菌的標準檢測方法均需要經過至少24 h的培養基培養后才能得出檢測結果，不能滿足應急檢測時檢測結果的及時性要求。從對比試驗分析，可以采用熒光定量PCR法應用于水體中大腸埃希氏菌的檢測，且熒光定量PCR法能在1～2 h內得出檢測結果，能更好地適用于水體大腸埃希氏菌的應急檢測需求。

3 結論

(1)使用熒光定量PCR法能檢測大腸埃希氏菌靶標基因gus，檢測濃度在101～ 107Copies/μL具有較高的線性關系。

(2)熒光定量PCR法檢測濃度梯度的大腸埃希氏菌樣品時，檢測結果與比濁法的菌液濃度數值相接近；在實際水樣檢測中，對含有標準菌株的不同類型水樣及水源水均能檢出陽性結果，管網水與出廠水均為陰性結果，含標準菌株樣品檢測結果與理論濃度值接近。PCR陰性對照結果為未檢出，陽性對照檢測結果分別為105 Copies/μL和93 Copies/μL，與標準濃度100 Copies/μL相接近。以上結果表明檢測方法的準確度高。濃度梯度標準水樣與實際水樣平行樣品間的相對標準偏差分別在3%～16%和8%～16%，檢測方法的精密度較好。方法適合于濃度在50 CFU/(100 mL)及以上樣品的定量檢測。

(3)熒光定量PCR法與酶底物法相關性分析，在系列濃度為50～2 000 CFU/(100 mL)的模擬水樣及實際水樣檢測中，兩種方法的相關系數r=0.99，相關性較好，經統計學分析兩種方法無顯著性差異，表明熒光定量PCR法能作為酶底物法的有效補充方法。