不同生長時期的紫花苜蓿對低溫的響應及其抗寒性研究

李佳奇， 劉曉靜， 運向凱， 韓顏隆

(甘肅農業大學草業學院,草業生態系統教育部重點實驗室,甘肅省草業工程實驗室, 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

低溫是限制牧草生長發育、地理分布和生產力的主要非生物脅迫因子[1-3]。在對青藏高原3個披堿草(Elymusdahuricus)屬牧草的苗期抗寒性研究中發現，低溫會引起植物細胞膜透性增大，電解質滲透率升高，而植物質膜透性越強，其細胞與組織就越容易受到損害，從而影響其產量和品質[4]；在對鵝觀草(RoegneriakamojiOhwi )與早熟禾(PoaannuaL.)的研究中發現，在低溫脅迫條件下，牧草細胞內產生主要為可溶性糖和游離脯氨的滲透調節物質，緩解在低溫脅迫下對植物傷害的發生[5-6]。關于牧草的抗寒研究還集中在品種之間的差異，如賈祥等研究4種禾本科牧草的抗寒性后發現，低溫環境下垂穗披堿草(ElymusnutansG.)、紫花針茅(StipapurpureaG.)的抗寒性最為優良[7]；梁國玲等對4種羊茅屬牧草的幼苗抗寒性進行了研究，其中中華羊茅(FestucasinensisKeng)的抗寒性最為優良[8]；趙桂琴等對4℃下不同品種紅三葉(TrifoliumpratenseL.)苗期的生理響應進行研究，發現R-1品種抗寒性最好[9]。紫花苜蓿作為優質的多年生豆科牧草，在畜牧業生產上發揮著重要的作用，由于紫花苜蓿具有高產、優質、保持水土、改良土壤、抗旱性較強等優點，是目前我國廣泛種植的優質牧草[10]。隨著研究的深入，國內外學者對苜蓿抗寒性的研究較多，如郝培彤等[11]研究科爾沁地區不同品種苜蓿根頸耐寒機理；趙一航等[12]對4個紫花苜蓿品種對低溫脅迫的響應進行了研究，表明“肇東”與“龍牧801”抗寒性較好；陳衛東等[13]研究表明黃花苜蓿抗寒性優于紫花苜蓿，而關于紫花苜蓿在不同生長時間對低溫的響應及耐受性的研究較少。近年來，由于我國種植業結構的調整，我國北方紫花苜蓿種植面積不斷擴大[14]，但由于紫花苜蓿在寒冷地區生長受限，其品質下降明顯，優良紫花苜蓿品種的缺乏已成為限制北方寒冷地區發展的主要問題之一，篩選出適宜高緯度、高海拔播種的紫花苜蓿品種是提高作物產量的前提，結合北方寒冷地區的氣候因素及播種方式可知紫花苜蓿的播種時間一般為秋播，而選擇精確的秋播時間是紫花苜蓿能安全越冬的關鍵因子[15]。因此，本研究擬選取4個在北方廣泛種植的紫花苜蓿品種“龍牧801”,“甘農3號”,“WL298”,“WL343”，通過模擬試驗對2個紫花苜蓿秋播時期溫度及不同播種時間下形態特征及抗逆生理特性的研究，探究紫花苜蓿在不同生長時期對低溫的響應及耐受性，確定出紫花苜蓿安全越冬的秋播時期；同時，根據其在低溫條件下的成活率篩選出最為適宜的優良品種，以期為北方寒冷地區紫花苜蓿高效栽培提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

紫花苜蓿品種為“龍牧801”,“甘農3號”,“WL298”,“WL343”,“甘農3號”。紫花苜蓿種子來源為甘肅農業大學草業學院，“龍牧801”紫花苜蓿種子來源為黑龍江畜牧研究所，“WL298”與“WL343”紫花苜蓿種子來源為北京正道生態科技有限公司。

1.2 試驗設計

試驗于2020年8月10日在甘肅農業大學草業學院牧草試驗基地室外自然氣候條件下進行，采用盆栽土培法，日常管理同田間試驗。該試驗采用的花盆直徑為20 cm，高為12 cm，試驗土來自甘肅農業大學牧草試驗基地，肥力中等的種植土。試驗采用4個紫花苜蓿品種，設置3個不同生長時期(45 d，60 d，75 d)，西北寒冷地區氣溫最低能夠達到-20℃左右，而因土壤熱傳導率的不同土壤淺層溫度最低在-10℃左右。因此，本試驗選擇-5℃，-10℃進行模擬越冬處理，每個處理重復5次，共120盆。種植前選取顆粒飽滿、大小均等的種子，通過預處理后進行播種，每個花盆裝入2 kg土壤，穴播，每盆5穴，每穴5～6粒種子，每周澆一次水，使土壤濕潤且不溢出，后期間苗每盆留20株。試驗中的4個品種紫花苜蓿分別在播種后生長45 d，60 d，75 d時進行模擬越冬的低溫脅迫，即將整盆紫花苜蓿放置于溫度為-5℃和-10℃，濕度為60%，光照強度為230～300 μE·m-2·s-1，光周期為16 h光照/8 h黑暗的人工氣候室(溫度誤差±1℃)進行逐級降溫(降溫速率不超過2.5 ℃·h-1)，待溫度降到目標溫度(-5℃，-10℃)時停止，然后將全部植株移至常溫下緩苗24 h，待緩苗結束后進行相關指標的測定。

1.3 測定指標及方法

株高：各處理隨機選取10株，用直尺測量植株絕對高度，每個處理重復3次，計算出平均值。

鮮重(地上)：將植株沖洗干凈后，用濾紙吸去多余水分，將地上部分稱重，每個處理重復15次，計算出平均值。

根重：對單株鮮樣的地下部分進行稱重，每個處理重復15次，計算出平均值。

根體積：利用Epson根系掃描儀對活根進行掃描，再用WinRHIZO根系分析系統軟件獲得根體積數據，每處理重復3次，計算出平均值。

主根直徑：根頸與主根相連的膨大部位的直徑，計算出平均值。

相對電導率：采用電導率儀(DDS-307A)測定。

可溶性糖含量(Soluble sugar，SS)：參照鄒琦[16]方法，采用蒽酮法測定含量。單位：μmol·g-1。

可溶性蛋白含量(Soluble protein，SP)：采用考馬斯亮藍G-250染色法測定含量。單位：μmol·g-1。

游離脯氨酸含量(Free proline，Pro)：采用酸性茚三酮法測定含量。單位：mg·g-1。

丙二醛含量(Malonaldehyde，MDA)：采用硫代巴比妥酸法測定含量。單位：μmol·g-1。

成活率(%)=(低溫處理后成活植株數/低溫處理前植株數)×100%。

1.4 數據分析

采用SPSS 25.0 軟件進行計統計分析，差異顯著性采用Duncan法進行多重比較。

隸屬函數采用韓瑞宏等[17]的計算公式：

隸屬函數值計算公式:

R(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin)

(1)

反隸屬函數值計算公式:

R(Xij)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xmin)

(2)

上式中，Xij為i品種的j性狀的隸屬函數值，Xij為i品種的j性狀值，Xjmin為各品種j性狀的最小值，Xjmax為各品種j性狀的最大值。當j性狀與植物的抗寒性成正相關時，用(1)式；當j性狀與植物抗寒性成負相關時用(2)式。數據利用Microsoft Excel 2016處理數據及制圖。

2 結果與分析

2.1 不同生長時期紫花苜蓿生長特性

由表1可知，紫花苜蓿的播種時期不同，其株高和地上生物量不同，在75 d達到最大值且顯著高于45 d(P<0.05)。其中，在播種45 d和60 d后“WL298”的株高均顯著高于其它品種；播種75 d后，“WL343”和“WL298”的株高均顯著大于“龍牧801”(P<0.05)。播種45 d后，“WL343”與“甘農3號”的地上鮮重均顯著高于“WL298”與“龍牧801”；播種60 d后，“龍牧801”的生物量顯著高與其它紫花苜蓿品種；播種75 d后，“WL343”的生物量達到了12.64 g高于其它品種(P<0.05)。

表1 不同時期紫花苜蓿品種的生長特性Table1 Growth characteristics of alfalfa varieties in different periods

2.2 不同生長時期紫花苜蓿根系特性

由表2可知，紫花苜蓿的播種時期不同，其根重、根體積和主根直徑不同，總體上在75 d達到最大值且顯著高于45 d(P<0.05)。播種45 d后，“龍牧801”的根重顯著高于其它苜蓿品種，播種60 d，75 d后，4個紫花苜蓿品種之間根重差異顯著，其中，“龍牧801”顯著高于其它紫花苜蓿品種(P<0.05)。在3個播種時間下，“龍牧801”根體積顯著高于其它紫花苜蓿品種(P<0.05)。在主根直徑方面，播種后45 d和60 d，4個紫花苜蓿品種之間主根直徑差異不顯著；在播種后75 d，“龍牧801”的主根直徑顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)。

表2 不同時期紫花苜蓿品種的根系特性Table 2 Root characteristics of alfalfa varieties in different periods

2.3 模擬越冬對不同生長時期紫花苜蓿生理特性的影響

2.3.1丙二醛(MDA) 由表3可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種在45 d的丙二醛含量均顯著高于75 d的丙二醛含量(P<0.05)。在-5℃條件下，播種 45 d和60 d后，“甘農3號”的丙二醛含量顯著高于“WL343”與“龍牧801”；在播種75 d后，“甘農3號”的丙二醛的含量顯著高于其它紫花苜蓿品種(P<0.05)。在-10℃條件下，播種45 d后，“甘農3號”丙二醛的含量顯著高于“龍牧801”；播種60 d后，“甘農3號”的丙二醛含量顯著高于“WL298”和“龍牧801”；在播種75 d后，“甘農3號”與“WL298”丙二醛含量顯著高于“WL343”與“龍牧801”(P<0.05)。

表3 不同播種時間及不同溫度下紫花苜蓿的丙二醛含量Table 3 Malondialdehyde content of alfalfa at different sowing time and temperature 單位：μmol·g-1

2.3.2游離脯氨酸(Pro) 由圖1可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿的游離脯氨酸含量均呈上升趨勢，并在75 d達到峰值且顯著高于45 d與60 d(P<0.05)。在-5℃條件下，播種45，60和75 d后，“龍牧801”的游離脯氨酸含量顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)。在-10℃條件下，播種45 d后，“龍牧801”的游離脯氨酸含量顯著高于其它苜蓿品種；播種60 d和75 d后，“WL343”的游離脯氨酸含量均顯著小于其它苜蓿品種(P<0.05)。

圖1 不同播種時間及不同溫度下紫花苜蓿的游離脯氨酸含量Fig.1 Free proline content of alfalfa under different sowing time and temperature注：每列中不同字母表示差異達5%水平，小寫字母表示不同品種間差異，大寫字母表示播種時期間差異，下同Note：Different letters mean significant at 5% level in theTable,lowercase letters indicate the difference between different varieties,and uppercase letters indicate the difference between sowing periods, the same as below

2.3.3相對電導率 由表4可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種的電導率均呈下降趨勢，表明隨著播種時間的增大紫花苜蓿的抗逆性能逐漸增加。在-5℃條件下，播種45 d后，4個紫花苜蓿品種的相對電導率差異不顯著；播種60 d后，“甘農3號”電導率顯著高于其它紫花苜蓿品種；播種75 d后，“WL298”和“甘農3號”的相對電導率顯著高于“WL343”與“龍牧801”(P<0.05)。在-10℃條件下，播種45 d后，“龍牧801”電導率顯著低于其它紫花苜蓿品種；播種60 d和75 d后，“甘農3號”與“WL298”電導率顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)。

表4 不同播種時間及不同溫度下紫花苜蓿的電導率Table 4 Electrical conductivity of alfalfa at different sowing time and temperature

2.3.4可溶性蛋白含量(SP) 由圖2可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種的可溶性蛋白含量逐漸增加，且在75 d的積累量顯著高于45 d與60 d(P<0.05)。在-5℃條件下，播種45 d后，其中“龍牧801”的可溶性蛋白含量顯著高于“甘農3號”的可溶性蛋白含量；在播種60 d后“龍牧801”與“WL343”的可溶性蛋白含量顯著高于其它紫花苜蓿品種；在播種后75 d，“甘農3號”的可溶性蛋白均顯著低于其它紫花苜蓿品種(P<0.05)。在-10℃的條件下，在播種45 d和60 d后，“龍牧801”的可溶性蛋白含量顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)。

圖2 不同播種時間及不同溫度下紫花苜蓿的可溶性蛋白含量Fig.2 Soluble protein content of alfalfa at different sowing time and different temperature

2.3.5可溶性糖含量(SS) 由表5可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種的可溶性糖含量呈上升趨勢，并在75 d達到峰值，且顯著高于45 d與60 d(P<0.05)。在-5℃條件下，播種45，60及75 d后，4個紫花苜蓿品種的可溶性糖含量無明顯差異(表5)。在-10℃的條件下，在播種45 d后，“龍牧801”的可溶性糖含量顯著低于其它紫花苜蓿品種；播種60 d和75 d后，“龍牧801”可溶性糖含量顯著高于其它苜蓿品種(P<0.05)。

表5 不同播種時間及不同溫度下紫花苜蓿的可溶性糖含量Table 5 Soluble sugar content of alfalfa at different sowing time and temperature 單位：μmol·g-1

2.4 模擬越冬下不同生長時期紫花苜蓿的成活率

由圖3可知，在-5℃與-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種的成活率逐漸增大，75 d的成活率顯著高于45 d與60 d的成活率(P<0.05)。-5℃與-10℃條件下，不同品種紫花苜蓿低溫脅迫后的成活率總體上規律一致，其中在播種后45 d，4個紫花苜蓿品種成活率差異不顯著；在播種后60 d，“龍牧801”紫花苜蓿品種成活率顯著高于“甘農3號”與“WL298”紫花苜蓿品種；在播種后75 d，-5℃條件下，“龍牧801”的成活率顯著高于其它品種而在-10℃條件下，“龍牧801”與“WL343”顯著高于“甘農3號”與“WL298”(P<0.05)。

圖3 不同苜蓿品種低溫脅迫后成活率差異Fig.3 Difference of survival rate of different alfalfa varieties under low temperature stress

2.5 紫花苜蓿模擬越冬下的成活率與其生長特性的相關性

本試驗在變量均為正態分布的情況下，利用Pearson相關系數法對4個品種紫花苜蓿的成活率與株高、鮮重(地上)、根重、根體積進行相關性分析(表6)，根據顯著性判斷，株高、鮮重(地上)、根重、根體積與成活率呈顯著相關，根據相關系數可知，株高與成活率顯著相關，成活率與地上鮮重、根重、根體積和根直徑極顯著相關。

表6 成活率與生長特性相關性Table 6 Correlation between survival rate and growth characteristics

2.6 不同生長時期紫花苜蓿抗寒性綜合評價

本試驗應用隸屬函數對4個紫花苜蓿品種的形態指標和生理指標共12項指標進行綜合分析(表7)。結果顯示：“龍牧801”的抗寒性最強，隸屬函數均值達到了0.556，其次是“WL343”與“WL298”“甘農3號”的抗寒性最差，隸屬函數均值僅有0.313。

表7 不同生長時期紫花苜蓿抗寒性綜合評價Table 7 Comprehensive evaluation of cold resistance of alfalfa in different growth stages

3 討論

紫花苜蓿選擇適宜播種時期是其栽培過程中的重要技術環節，也是影響紫花苜蓿生長發育、產量及越冬的重要因素[18]。本研究中，通過比較4個紫花苜蓿品種3個不同生長時間的生理指標得出，在播種75 d后的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸及成活率均優于45 d和60 d。研究還發現，通過對低溫脅迫后紫花苜蓿成活率比較得出，在播種后45 d，溫度達到-5℃與-10℃的成活率均低于20%，無法越冬；在播種后60 d，-5℃條件下，4個紫花苜蓿品種的成活率達到了40%左右；在-10℃條件下，“甘農3號”的成活率為28%，而“龍牧801”的成活率為45%，4個紫花苜蓿品種成活率差異顯著，這說明4個紫花苜蓿品種在播種后60 d對低溫的耐受程度較低，僅有“龍牧801”紫花苜蓿品種能夠勉強越冬；在播種后75 d，-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種的成活率均達到55%以上，說明4個紫花苜蓿品種可以安全越冬。此外，隨著溫度的逐漸降低，紫花苜蓿體內的可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸均在播種后75 d的積累量大于在播種后60 d的積累量，這可能是由于紫花苜蓿在播種60 d后，紫花苜蓿體內的抗寒機制尚未完善，而在播種后75 d，紫花苜蓿體內的營養物質積累量更大，使其地上鮮重、根直徑、根體積增大，從而積累了脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等物質，完善了紫花苜蓿的抗寒機制。因此，當環境最低溫達到-10℃時，4個紫花苜蓿品種在入冬前75 d播種最為安全。

根系是植物吸收、轉化和儲存養分的重要器官，植物地上部分的發育狀況與根系密切相關，進而影響了紫花苜蓿的生產性能[19-20]。已有研究表明，紫花苜蓿安全越冬與其地上生物量、根頸粗細程度顯著相關，孫啟忠認為冬季來臨之前，紫花苜蓿的主根直徑達到3 mm就能安全越冬[21-24]。本研究中，利用Pearson相關系數法對4個紫花苜蓿品種的成活率與其株高、鮮重(地上)、根重和根體積進行相關性分析，發現4個紫花苜蓿品種的單株鮮重、主根直徑、根重和根體積與成活率均呈極顯著正相關，且地上鮮重及根體積、主根直徑對其越冬率影響最為顯著，這與王運濤等[20]對不同苜蓿品種根系形態特征研究中發現紫花苜蓿的主根直徑與成活率呈顯著相關的規律相似。由于品種之間的差異，“龍牧801”紫花苜蓿品種的根重、根體積顯著高于其它紫花苜蓿品種，這可能是由于抗寒性強的紫花苜蓿品種會隨著溫度降低其地上部分生長緩慢甚至停止，并且植物所儲藏的營養物質部分還會從地上向地下轉移[23]。而“WL343”紫花苜蓿品種地上鮮重與株高的增長速度均高于其它紫花苜蓿品種，其根重和根體積僅次于第一的“龍牧801”，又根據本試驗紫花苜蓿成活率與生長特性相關性的結果可知，“龍牧801”與“WL343”紫花苜蓿品種均具有較強的抗寒性。

諸多研究表明，相對電導率、丙二醛、游離脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均可作為評價苜蓿品種抗寒性的重要生理指標[25-27]。Lyons認為，當植物受到低溫脅迫時，細胞膜的透性會增大，電解質會不同程度的滲漏，導致細胞膜系統損壞[28]。丙二醛作為細胞膜脂過氧化作用的產物之一，它的產生會使植物的細胞膜系統受到不同程度的損傷，而大量糖類物質能提高植物細胞的滲透勢，保護細胞的穩定性[29-30]。本研究表明，“龍牧801”與“WL343”在低溫脅迫后的丙二醛含量均低于其它苜蓿品種，可溶性糖含量與游離脯氨酸含量均高于其它紫花苜蓿品種，表明“龍牧801”與“WL343”苜蓿品種抗寒性能優良。李倩等[31-32]研究認為抗寒性與丙二醛含量呈負相關，與可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量與抗寒性呈顯著正相關。本試驗通過對7項形態指標與5項生理生化指標進行隸屬函數綜合分析，得出了4個紫花苜蓿品種綜合抗寒性順序：“龍牧801”>“WL343”>“WL298”>“甘農3號”，說明“龍牧801”與“WL343”紫花苜蓿品種抗寒性較為優良。

4 結論

本研究中，通過相關性分析與隸屬函數綜合評價得出“龍牧801”的抗寒綜合表現最佳，“WL343”次之。在模擬越冬-5℃和-10℃條件下，4個紫花苜蓿品種在播種后生長45 d時成活率均極低；在生長60 d時的成活率除“龍牧801”以外，其它3個品種成活率均低于50%，在生長75 d時在-5℃和-10℃條件下的成活率均高于55%。因此，西北地區秋播紫花苜蓿在入冬前至少保證75 d的生長時間越冬最為安全，對于某些抗寒品種如“龍牧801”可適當推遲秋播時間，但也應在入冬前60 d之前播種。