貴州巖溶山區(qū)多花木藍(lán)根瘤菌及高效菌株篩選

韋興迪， 曾慶飛， 韋 鑫， 李亞嬌， 歐二綾， 劉正書

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草業(yè)研究所， 貴州 貴陽 550006)

貴州省位于云貴高原東部，是我國唯一一個沒有平原支撐的內(nèi)陸高原山區(qū)省，也是喀斯特地貌發(fā)育最強烈、分布面積最大的典型區(qū)域[1]。在喀斯特地區(qū)石漠化生態(tài)修復(fù)過程中，豆科灌木具有植株高大、耐貧瘠、營養(yǎng)豐富、抗逆性和適應(yīng)性強等特點，能明顯改善土壤微環(huán)境，為其他植物的遷移、定居、生長創(chuàng)造條件，從而促進(jìn)退化生態(tài)系統(tǒng)植被演替與恢復(fù)[2]，已經(jīng)成為巖溶山區(qū)農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)治理的寶貴植物資源[3]。多花木藍(lán)(Indigoferaamblyantha)作為一種優(yōu)質(zhì)豆科飼用灌木和抗逆先鋒植物，由于其具有耐干旱、耐貧瘠、耐踐踏、耐刈割、適口性好、粗蛋白質(zhì)含量高、青綠期長等特點，被評價為改良干旱、半干旱地區(qū)退化草地和建植人工放牧草地的優(yōu)良飼用灌木，也是喀斯特山區(qū)石漠化治理的重要先鋒植物之一[4-5]。本課題組在云貴高原天然豆科牧草根瘤菌資源調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)，貴州巖溶山區(qū)野生多花木藍(lán)分布廣泛，共生結(jié)瘤能力強，在干燥貧瘠的坡地以及石芽石縫中也能頑強生長，推測其根系定殖著豐富的、適應(yīng)石漠化生境的共生根瘤菌[6]。因此，挖掘利用野生多花木藍(lán)共生微生物資源，對于推動地區(qū)農(nóng)業(yè)及草地生態(tài)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

國內(nèi)外有關(guān)多花木藍(lán)的研究報道大多與其營養(yǎng)價值、栽培利用、生產(chǎn)表現(xiàn)，以及多花木藍(lán)根系叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)的調(diào)查、分析等有關(guān)[7-8]，但針對環(huán)境特殊的貴州巖溶山區(qū)多花木藍(lán)根瘤菌的資源研究還較為缺乏。本研究除了調(diào)查貴州巖溶山區(qū)野生多花木藍(lán)根瘤菌的資源蘊藏狀況并揭示其區(qū)系分布特征以外，還將從采自貴州省不同喀斯特地貌區(qū)域的野生多花木藍(lán)分離鑒定的多花木藍(lán)根瘤菌中，篩選出適應(yīng)本地喀斯特環(huán)境、能在豆科作物根系內(nèi)定殖共生并高效固氮促生的根瘤菌株。根瘤菌侵染豆科植物形成根瘤是一個十分復(fù)雜的過程，這一共生固氮系統(tǒng)的有效建立，首先需要根瘤菌與豆科植物的識別匹配[9]，不同種類的根瘤菌與豆科植物之間相互存在著一個識別選擇范圍[10]。除此之外，生態(tài)地理環(huán)境對豆科植物根瘤菌的多樣性也存在著重要影響，根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的建立是細(xì)菌、植物及環(huán)境三個因素相互作用的結(jié)果[11-12]，根瘤菌與豆科植物的共生關(guān)系會因生態(tài)環(huán)境的差異而呈現(xiàn)出種類的多樣性[13]。根瘤菌對共生宿主植物的識別選擇具有一個相對的種類專一性范圍，一般而言，從特定種類豆科植物根瘤中分離出的根瘤菌都能與該種植物識別共生。為了獲得共生匹配范圍較廣的優(yōu)良根瘤菌株，本研究沒有選用多花木藍(lán)，而是選擇了豆科牧草百脈根(LotuscorniculatusL.)作為回接宿主植物。百脈根作為豆科百脈根屬多年生叢生草本植物，由于營養(yǎng)豐富、干物質(zhì)消化率高、適口性好、根系強大等特點，既是一種優(yōu)良的豆科牧草和飼用植物，又是一種具有良好水土保持性能的抗逆先鋒植物[14-17]。因此，選擇來自不同地域的不同種類的多花木藍(lán)根瘤菌與百脈根進(jìn)行盆栽植物回接試驗，結(jié)合菌株固氮酶活性的測定，篩選出結(jié)瘤固氮能力強、植物促生效果好的優(yōu)良菌株，可進(jìn)一步探明野生多花木蘭根瘤菌資源，利用豐富的豆科牧草共生資源積極推動“綠色整治、生態(tài)修復(fù)”發(fā)展草地生態(tài)畜牧業(yè)，對于貴州巖溶地區(qū)農(nóng)業(yè)及草地生態(tài)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和喀斯特生態(tài)環(huán)境修復(fù)提供可利用的微生物資源和研究基礎(chǔ)，具有重要而深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義[18]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1根瘤樣品 按照《貴州省生態(tài)功能區(qū)劃》[19]發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)，本試驗選擇了5個不同的生態(tài)功能區(qū)為采樣區(qū)(涉及22個縣)，具體為：(1)北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)，屬亞熱帶季風(fēng)氣候；(2)南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)，位于貴州南部，屬典型的亞熱帶溫暖溫潤的季風(fēng)氣候；(3)中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)，位于貴州中西部，屬典型的高原型濕潤亞熱帶季風(fēng)氣候；(4)東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)，位于貴州省東北部，屬中亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候區(qū)；(5)西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)，位于貴州高原西南部，屬亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候。共采集野生多花木藍(lán)根瘤樣品44份，具體采集地點及根瘤樣品編號見圖1。

1.1.2牧草種子 盆栽回接試驗用百脈根種子(品種名：‘歌德’)購于貴陽霖卉園林綠化有限公司。

1.2 根瘤菌株的分離純化

將采集到的多花木藍(lán)根段及根瘤表層泥土沖凈，吸水紙吸干表面水分，將干燥的根瘤在無菌水中浸泡至吸脹，挑取10～20顆碩大飽滿的單個根瘤放入無菌小燒杯中，在超凈工作臺內(nèi)用95%的乙醇浸泡5 min，接著換用0.1%的HgCl2浸泡5 min，無菌水洗滌5～l0次后轉(zhuǎn)至無菌研缽中，加入1000 μL無菌水研磨成懸濁液，用移液槍將懸濁液轉(zhuǎn)至加有剛果紅的酵母甘露醇瓊脂(Yeast mannitol agar，YMA)培養(yǎng)基上，均勻涂布，28℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫倒置培養(yǎng)3～7 d。每天觀察1次，挑取不吸色、菌落圓形、邊緣整齊、表面光滑而隆起、濕潤黏稠、略透明或半透明的典型單菌落，用平板劃線法接種于另一新的YMA平板上，倒置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)恒溫培養(yǎng)。長出菌落后挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，若不純，進(jìn)一步純化，直至獲得純化菌株。將純化菌株接種至YMA液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)7 d后用30%甘油保種，—70℃超低溫冰箱中凍存。

圖1 野生多花木藍(lán)根瘤樣品編號及采集地點Fig.1 Root nodule sample numbers of wild Indigofera amblyantha and their sampling sites注：審圖號GS(2021)5448號Note:Drawing No. GS(2021)5448

1.3 根瘤菌株的鑒定與區(qū)系分析

1.3.1根瘤菌株的形態(tài)學(xué)鑒定 參照一般細(xì)菌常用鑒定方法[20]，對純化后革蘭氏染色鏡檢為紅色的G-菌株，進(jìn)一步觀察菌體形態(tài)特征。

1.3.2根瘤菌株的16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)提取分離純化獲得的各菌株的總DNA，選用P1—P6通用引物對擴(kuò)增各菌株的16S rDNA片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后與質(zhì)粒PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α；篩選得到轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒DNA并經(jīng)酶切驗證后，送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司昆明分公司測序。將測得的菌株序列使用NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)中的Blast軟件在線比對，并從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載與待分析序列相近的已知種模式菌株的16S rDNA序列，用DNAMAN進(jìn)行多重比對，確定各菌株的種屬分類地位。

1.3.3根瘤菌株的區(qū)系分析 根據(jù)分離菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，統(tǒng)計所有種類根瘤菌在研究區(qū)中的種屬組成、分離頻度，對其優(yōu)勢種及生境分布多樣性進(jìn)行分析。分布頻率采用相對頻率分別計算，計算公式：

分離頻度(%)=

(某個種出現(xiàn)的樣品數(shù)/總樣品數(shù))×100%

1.4 優(yōu)良根瘤菌株的盆栽回接篩選

1.4.1供試菌株 基于菌株盆栽回接篩選試驗的工作量大，同一地域同一宿主植物的同種根瘤菌株的生理代謝與固氮促生功能的相似性，不同地理生態(tài)環(huán)境、不同種類的根瘤菌株之間的代謝功能特性的差異性等特點，本試驗從已純化的根瘤菌菌株種優(yōu)先選擇其不同地域、不同種類的具有代表性的多花木藍(lán)根瘤菌作為盆栽篩選試驗供試菌株。

1.4.2盆栽播種 選取發(fā)芽率正常的百脈根種子，先用75%的乙醇浸泡2 min，無菌水清洗2～3次，再用3%的次氯酸鈉消毒10 min，無菌水清洗5～6次后，播種于基質(zhì)為滅菌珍珠石的花缽中。將花盆置于室溫25℃、每天光照16 h的人工氣候室中培養(yǎng)。待種子發(fā)芽長出幼苗后，噴施Hoagland全營養(yǎng)液(上海國藥)，生長26 d后每盆保留生長一致的幼苗10株用于菌液回接處理。

1.4.3菌液培養(yǎng) 從—70℃超低溫冰箱中取出用于篩選試驗的保種根瘤菌株，無菌接種環(huán)蘸取劃線接種于YMA平板上，28℃恒溫倒置活化培養(yǎng)后，挑取單菌落接種于500 mL YMA液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)5～7 d。

1.4.4盆栽回接篩選 每個菌株回接3個百脈根花盆(3次重復(fù))，并以澆灌無菌YMA液體培養(yǎng)基作為空白對照(CK)，每個花盆回接菌液或培養(yǎng)基的體積為50 mL。每天澆灌少量Hoagland營養(yǎng)液保持基質(zhì)濕潤。菌液回接68 d、盆栽生長94 d后，將盆內(nèi)植株取出，沖凈后用吸水紙吸取根表面的水分，首先統(tǒng)計各處理植株的根瘤數(shù)，再在每一處理的每個重復(fù)中隨機選取3個百脈根植株，另外再選擇1個長勢適中的植株，共10個植株，取出沖洗干凈后統(tǒng)計根瘤數(shù)，計算單株根瘤數(shù)的平均值；然后將地上、地下部分分離，于105℃殺青30 min，在85℃下烘干12 h至恒重后，采用萬分之一電子天平稱重，測定各處理植株的地上生物量和地下生物量。

1.5 菌株的固氮酶活性測定

將所有待測菌株接種于CCM培養(yǎng)平板上劃線，28℃培養(yǎng)5～7 d，采用固氮酶(NITS)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(青島科創(chuàng)質(zhì)量檢測有限公司)測定固氮酶活性。以O(shè)D值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為縱坐標(biāo)，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中固氮酶(NITS)活性濃度，其中回歸方程為Y=95.842 0x-3.958 5，R2=0.997 2。根據(jù)結(jié)瘤數(shù)、促生效應(yīng)及固氮酶活性篩選出高效菌株。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010整理數(shù)據(jù)，將獲得數(shù)據(jù)用LSD法進(jìn)行多重比較，同時使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離獲得的根瘤菌菌株及其形態(tài)特征

利用加有剛果紅的YMA平板分離和純化培養(yǎng)，共得到77個純化菌株。純化的菌株經(jīng)革蘭氏染色鑒定，獲得53個革蘭氏陰性(G-)保存菌株。對經(jīng)分離純化和革蘭氏染色鑒定呈G-的53個菌株進(jìn)行菌體形態(tài)觀察，菌體細(xì)胞均呈桿狀，長短不一，有莢膜或無莢膜，菌體表面均著生鞭毛，鞭毛端生、側(cè)生或周生，符合根瘤菌的基本形態(tài)特征(表1)。

表1 多花木藍(lán)根瘤菌菌株的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of Indigofera amblyantha rhizobial strains

2.2 根瘤菌株的種類鑒定與區(qū)系分析結(jié)果

利用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取53個G-保存菌株的總DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，均形成23 kb左右的條帶。利用P1—P6通用引物對，所有待測菌株均PCR擴(kuò)增出約1.5 kb的序列片段。按照1.3.2 的方法進(jìn)行菌株的種屬鑒定和分類，33個根瘤菌株的分子鑒定結(jié)果見表2。根據(jù)測定比對結(jié)果，結(jié)合菌體的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，53個G-菌株中有共生根瘤菌33株，其余20個菌株屬于根瘤內(nèi)生細(xì)菌。

表2 基于16S rDNA序列比對的多花木藍(lán)根瘤菌株分子鑒定結(jié)果Table 2 Taxonomic identification results of rhizobial strains of Indigofera amblyantha based on 16S rDNA sequence alignment

表3顯示野生多花木藍(lán)根瘤菌種類和區(qū)系分布，共6屬22種根瘤菌。6個屬分別是：根瘤菌屬(Rhizobium)、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、中慢生根瘤菌屬(Mesorhizobium)，其中根瘤菌屬的分布頻率最高，達(dá)33.33%，慢生根瘤菌屬其次，達(dá)30.30%，為優(yōu)勢屬；慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)的分布頻率最高，達(dá)到15.15%，為優(yōu)勢種。

5個生態(tài)功能區(qū)多花木藍(lán)根瘤菌的分類、種屬分布如表4。在北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)只鑒定出Rhizobium和Bradyrhizobium2個屬的4個種；在南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)鑒定出Rhizobium，Bradyrhizobium，Burkholderia，Pseudomonas和Agrobacterium5個屬的8個種；在中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)只鑒定出Rhizobium和Burkholderia2個屬的5個種；在東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)鑒定出Rhizobium，Bradyrhizobium，Mesorhizobium，Burkholderia，Pseudomonas和Agrobacterium6個屬的8個種；在西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)僅鑒定出Bradyrhizobium1個屬的3個種。5個生態(tài)功能區(qū)多花木藍(lán)根瘤菌的種屬分布存在著明顯的差異，如：Mesorhizobium只在東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)被分離得到，西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)僅鑒定出Bradyrhizobium，中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)鑒定出屬于Rhizobium屬的種類分布最為豐富。

表3 多花木藍(lán)根瘤菌株區(qū)系分析結(jié)果Table 3 The result of floristic analysis of rhizobial strains of Indigofera amblyantha

表4 研究區(qū)多花木藍(lán)根瘤菌的種屬分布特征Table 4 Species distribution characteristics of Indigofera amblyantha rhizobia in the study area

續(xù)表4

2.3 共生結(jié)瘤固氮高效根瘤菌株的篩選

選擇來自不同地域、不同種類的13個根瘤菌株(CCIR3-1，WHIR26-2，LMIR32-1，MHIR57-2，SZIR67-2，SZIR67-5，DHIR236-3，HBIR252-6，MXIR316-1，LXIR323-2，JCIR335-1，JCIR336-2，JCIR336-6)回接百脈根幼苗進(jìn)行篩選試驗。

菌液回接68 d、盆栽生長94 d后，經(jīng)根瘤菌接種處理的百脈根長勢較好、植株較高、葉片顏色較深，未經(jīng)根瘤菌接種處理的對照組(CK)長勢較差、植株弱小、葉片較小且顏色較淺，處理組與對照組相比表觀差異明顯(圖2)。

根瘤平均數(shù)、地上部干重、地下部干重的測定結(jié)果見表5。與對照組(CK)相比，試驗組中的13個菌株的共生結(jié)瘤和促生作用均有所提高，每盆平均結(jié)瘤數(shù)在6～50之間。綜合根瘤數(shù)、地上部干重和地下部干重3項測定指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)其中6個菌株(CCIR3-1，LMIR32-1，SZIR67-5，HBIR252-6，MXIR316-1和JCIR335-1)的結(jié)瘤促生效果十分明顯，與對照差異顯著(P<0.05)；其中，菌株LMIR32-1的根瘤數(shù)、地上地下部干重與其余12個供試菌株的差異顯著(P<0.05)。

圖2 百脈根盆栽回接篩選部分處理圖片F(xiàn)ig.2 Partial treatment pictures of Lotus corniculatus potted back inoculation screening experiment

表5 百脈根盆栽回接篩選試驗測定結(jié)果Table 5 The determination results of the potted back inoculation and screening test of Lotus corniculatus

2.5 供試菌株固氮酶的活性

13個供試根瘤菌株均具有固氮酶活力(37.33～263.05 IU·L-1)(表6)。不同菌株的固氮酶活性存在差異；其中促生效果較好的6個菌株的固氮酶活性也相對較高，活性大小順序為：LMIR32-1>MXIR316-1>SZIR67-5>JCIR335-1>CCIR3-1>HBIR252-6，與其余7個菌株間都呈現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)。

表6 供試根瘤菌株固氮酶活性測定結(jié)果Table 6 Measured result of nitrogenase activity of the experimental rhizobium strains 單位:IU·L-1

綜合促生效果與結(jié)瘤固氮能力分析，在13個供試菌株中，分離自羅甸縣沫陽鎮(zhèn)野生多花木藍(lán)根瘤樣品的菌株LMIR32-1具有最高的固氮酶活性以及最強的結(jié)瘤促生能力，屬于供試菌株中的最優(yōu)固氮根瘤菌株；另外，分別分離自長順長寨、三都中和、赫章白果、麻江杏山和劍河岑松多花木藍(lán)根瘤樣品的5個菌株CCIR3-1，SZIR67-5，HBIR252-6，MXIR316-1和JCIR335-1，與除最優(yōu)根瘤菌株LMIR32-1以外的其余7個菌株的促生效果和結(jié)瘤固氮能力均呈現(xiàn)顯著或極顯著的差異，屬于篩選出的優(yōu)良根瘤菌株。

3 討論

能與多花木藍(lán)識別共生的根瘤菌的種類范圍在國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報道，本研究在貴州5個不同生態(tài)功能區(qū)的野生多花木藍(lán)根瘤樣品中，共分離鑒定出6個屬22個種的根瘤菌，其中東部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)和南部干熱河谷南亞熱帶季雨林生態(tài)區(qū)被分離鑒定出的多花木藍(lán)根瘤菌的種屬數(shù)量最多，中部濕潤亞熱帶喀斯特脆弱生態(tài)區(qū)和北部濕潤亞熱帶常綠闊葉林生態(tài)區(qū)的種屬數(shù)次之，西部半濕潤亞熱帶針闊混交林、草山喀斯特脆弱環(huán)境生態(tài)區(qū)的最少，只有1個屬的3個種。這說明，在5個不同氣候類型的生態(tài)功能區(qū)域中，因為不同的溫度、光照、土壤類型及水分條件，最終形成了多花木藍(lán)根瘤菌不同的區(qū)系分布特征，共生根瘤的形成直接受到細(xì)菌、植物及生態(tài)地理環(huán)境三個因素的共同影響，這一結(jié)果與陳文新等[13]的研究結(jié)論是一致的。

本研究在對多花木藍(lán)根瘤樣品進(jìn)行菌株分離時，最初采用的是常規(guī)使用的根瘤壓破劃線法[21]，但隨即發(fā)現(xiàn)這一方法分離效率極低，原因可能是每一次都是野外連續(xù)幾天的調(diào)查采樣，當(dāng)天采集的新鮮根瘤樣品不能得到及時的分離，待到分離時根瘤已經(jīng)處于干燥狀態(tài)，即使用無菌水浸泡吸脹后，壓破的根瘤中的汁液依然很少。后來采用無菌水研磨根瘤涂布平板法，發(fā)現(xiàn)分離效果得到了明顯的提高。但總體而言，從44份野生多花木藍(lán)根瘤樣品中分離得到53個革蘭氏陰性菌株，經(jīng)鑒定其中只有33個屬于共生根瘤菌，另有20個菌株屬于在根瘤內(nèi)與根瘤菌一起共生的根瘤內(nèi)生細(xì)菌，說明改進(jìn)后的分離方法對于根瘤菌株的分離也未達(dá)到理想的效果，根瘤菌的分離手段尚需進(jìn)一步的改良優(yōu)化。盡管如此，本試驗所采用的改進(jìn)后的研磨涂布平板法分離得到的菌株仍然能在一定程度上反映出不同生態(tài)功能區(qū)域多花木藍(lán)根瘤菌區(qū)系分布的差異性特征。

本研究在百脈根盆栽回接篩選試驗中，根據(jù)共生結(jié)瘤數(shù)、對共生宿主植物的促生效果以及菌株本身的固氮酶活性三項指標(biāo)，篩選獲得了6株促生固氮效果良好的根瘤菌，結(jié)瘤促生效果和固氮酶活性與其余7個供試菌株都呈現(xiàn)出顯著或極顯著的差異，其中分離自羅甸縣沫陽鎮(zhèn)野生多花木藍(lán)根瘤樣品的菌株LMIR32-1被鑒定為優(yōu)良菌株中的最優(yōu)固氮根瘤菌株。由于根瘤菌的固氮促生機理十分復(fù)雜，其中根瘤內(nèi)生細(xì)菌也具有不可忽視的協(xié)同作用，因此，根瘤菌的促生固氮能力不完全取決于菌株的固氮酶活性，但是固氮酶活力較高的菌株，其共生固氮能力一定較強[22]。

4 結(jié)論

從分離自貴州巖溶山區(qū)5個不同生態(tài)功能區(qū)的多花木藍(lán)根瘤菌中，優(yōu)先選擇13個來自不同地域和不同種類的菌株作為篩選對象，其中6個菌株(LMIR32-1，MXIR316-1，SZIR67-5，JCIR335-1，CCIR3-1和HBIR252-6)對水土保持性能良好的抗逆先鋒植物百脈根具有良好的共生結(jié)瘤和固氮促生效果，具有開發(fā)應(yīng)用潛力。篩選出的6個高效根瘤菌株及其與多花木藍(lán)和百脈根建立的優(yōu)勢共生體系，將為地區(qū)草地生態(tài)畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展和喀斯特環(huán)境的修復(fù)與治理提供有效的物質(zhì)和技術(shù)支持。