阿托伐他汀對大鼠腦缺血再灌注神經(jīng)功能的保護(hù)作用及機(jī)制

樊明新，田 剛，祖麗菲亞

(新疆心腦血管病醫(yī)院神經(jīng)外科，烏魯木齊 830000)

當(dāng)前，缺血性腦血管疾病具有較高的發(fā)病率和致死率，嚴(yán)重威脅著人類的健康。缺血性腦卒中是缺血性腦血管疾病中最常見的一種類型，主要因?yàn)槟X血管損傷、血栓脫落及血管局部動(dòng)脈粥樣硬化等導(dǎo)致腦供血的動(dòng)脈栓塞，從而引發(fā)腦組織缺血、壞死，臨床上常運(yùn)用溶栓、抗凝藥物等改善腦血液循環(huán)，但血管再通所導(dǎo)致的腦缺血再灌注(cerebral ischemia-reperfusion,CIR)會(huì)進(jìn)一步加重腦組織損傷，一直以來是困擾臨床醫(yī)生的難題。CIR損傷的病理機(jī)制與線粒體損傷、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)[1-2]。因此，降低CIR后氧化應(yīng)激水平、減輕炎性反應(yīng)是防治CIR的關(guān)鍵之一。阿托伐他汀是一種新型人工合成降脂藥，可有效降低血清低密度脂蛋白膽固醇及總膽固醇水平，阻止血栓形成及改善血管內(nèi)皮功能，在預(yù)防急性心血管事件及延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展方面具有重要作用[3]。此外，阿托伐他汀具有抗炎和抗氧化作用，對缺血性損傷、急性炎癥性損傷等具有較好療效[4-6]，但其作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本研究探討阿托伐他汀對大鼠CIR神經(jīng)功能的保護(hù)作用及其可能機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠45只，體重200～220 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供。所有大鼠在實(shí)驗(yàn)開始前均自由采食、飲水。將大鼠分為假手術(shù)組(sham組)、缺血2 h或6 h再灌注組(cir_2h組，cir_6h組)及阿托伐他汀處理組(cir_2h+ATV組， cir_6h+ATV組)，每組9只。采用尼龍線栓法制備CIR模型[7]。cir_2h和cir_6h組大鼠分別缺血2、6 h后，再灌注48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。cir_2h+ATV組和cir_6h+ATV組大鼠，分別在術(shù)前灌胃給予阿托伐他汀混懸液，劑量10 mg/kg，每天灌胃1次，連續(xù)7 d，灌胃結(jié)束次日，大鼠分別缺血2、6 h后，再灌注48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑

阿托伐他汀(純度大于或等于98%)購自北京索萊寶試劑有限公司；依文思藍(lán)(EB)和甲酰胺均購自阿拉丁試劑(上海)有限公司；NO檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細(xì)胞介素(IL)-6檢測試劑盒均購自美國R&D公司；鼠源p-IκBα、兔源p-p65和鼠源IRF5均購自美國Novus公司；兔源p65和鼠源IκBα均購自美國Santa Cruz公司；山羊抗鼠和山羊抗兔的二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1神經(jīng)功能缺損評(píng)分

CIR后，對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分以評(píng)價(jià)大鼠神經(jīng)功能變化。評(píng)分參照Zea-Longa制訂的標(biāo)準(zhǔn)[8]：無明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀，0分；不能完全伸展左側(cè)前爪，1分；向左側(cè)旋轉(zhuǎn)，2分；行走時(shí)向左側(cè)傾倒，3分；不能自行行走，4分。積分越高，說明動(dòng)物行為障礙越嚴(yán)重。

1.3.2血腦屏障通透性測定

EB滲透法定量分析大鼠血腦屏障通透性變化[9]。大鼠缺血后，股靜脈注射2%EB(劑量2 mL/kg)。各組麻醉下用肝素化的生理鹽水對大鼠進(jìn)行心臟灌流，當(dāng)右心房流出的液體變清澈即可斷頭。將取出的腦組織稱重，剪碎浸入甲酰胺(1 mL/100 mg)，60 ℃水浴箱內(nèi)孵育24 h。離心取上清液，用分光光度計(jì)檢測上清液在波長620 nm的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量分析EB水平。

1.3.3腦含水率測定

大鼠在麻醉后迅速斷頭取腦，稱量腦濕重，110 ℃烘箱中烘干至恒重，稱量腦干重，計(jì)算腦含水率。腦含水率=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.3.4腦組織常規(guī)HE染色

取腦組織，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋后，制作石蠟切片；梯度二甲苯脫蠟后蘇木精染色3 min，自來水沖洗1 min；鹽酸酒精分化后用依紅染色15 s，自來水沖洗1 min；梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹脂封片，置于顯微鏡下觀察染色情況并拍照。

1.3.5ELISA檢測

腦組織按照每100 mg加入100 μL雙蒸水勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液，測定蛋白濃度。并按照ELISA試劑盒說明書測定NO、TNF-α和IL-6水平。

1.3.6熒光定量PCR檢測

液氮研磨腦組織至粉末狀，Trizol法提取組織RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件：95 ℃變性4 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。采用2-ΔΔCT法計(jì)算出各組中目的基因相對表達(dá)量。iNOS：上游引物5′-CGCTATGGCCGCTTCGATG-3′，下游引物5′-GGCAGGCAGCGCATACCAC-3′；eNOS：上游引物5′-CGGCCTGAGCAGCACAAGAG-3′，下游引物5′-CCCAGCCCAAACACACAGAAC-3′；β-actin：上游引物5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，下游引物5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′。

1.3.7Western blot檢測

收集各組大鼠腦組織，液氮研磨腦組織至粉末狀，加入胰蛋白酶和磷酸酶抑制劑及細(xì)胞裂解液，裂解20 min。4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，BCA法定量后，調(diào)整蛋白濃度，煮沸變性后添加loading buffer。取等量蛋白，10% SDS-PAGE電泳。采用濕轉(zhuǎn)法100 V 20 min將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后1×TBST洗膜1次，倒掉廢液，加適量5%脫脂奶粉液，室溫封閉2 h。1×TBST清洗3次，每次10 min，分別加入IRF5(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-p65(1∶1 000)、p65(1∶1 000)一抗，4 ℃搖床孵育過夜。1×TBST清洗3次，每次10 min，加入相應(yīng)的二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，1× TBST清洗3次，添加顯影液，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。曝光后使用image J進(jìn)行灰度分析，β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算p-IκBα/IκBα和p-p65/p65。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 阿托伐他汀對大鼠CIR后神經(jīng)功能缺損評(píng)分的影響

cir_2h組和cir_6h組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分較sham組明顯增加(P<0.01)，cir_6h組增加更明顯(P<0.01)，在阿托伐他汀處理后，神經(jīng)功能缺損評(píng)分明顯減少(P<0.05)，見圖1。

#：P<0.01，與sham組比較；**：P<0.01，*：P<0.05。

2.2 阿托伐他汀對大鼠CIR后血腦屏障通透性的影響

cir_2h組和cir_6h組大鼠腦組織中EB水平較sham組升高(P<0.01)，cir_6h組升高更明顯(P<0.01)，在阿托伐他汀處理后，EB水平明顯降低(P<0.05)，見圖2。

#：P<0.01，與sham組比較；*：P<0.05，**：P<0.01。

2.3 阿托伐他汀對大鼠CIR后腦含水率的影響

cir_2h組和cir_6h組大鼠的腦含水率較sham組明顯升高(P<0.01)，cir_6h組變化更明顯(P<0.01)，在阿托伐他汀處理后，腦含水率明顯降低(P<0.01)，見圖3。

2.4 阿托伐他汀對大鼠CIR后腦組織水腫及壞死的影響

sham組腦組織細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊；cir_2h組和cir_6h組神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)水腫，阿托伐他汀的處理一定程度上減輕了膠質(zhì)細(xì)胞的腫脹，這與腦含水率測定結(jié)果一致。隨著缺血時(shí)間的延長，腦組織中神經(jīng)元的損傷也逐漸加劇，并在cir_6h組中神經(jīng)元出現(xiàn)壞死的現(xiàn)象，阿托伐他汀處理后壞死減少，見圖4。

#：P<0.01，與sham組比較；**：P<0.01。

圖4 各組大鼠腦組織HE染色(×200)

2.5 阿托伐他汀對大鼠CIR后腦組織TNF-α、IL-6及NO水平的影響

cir_2h組和cir_6h組大鼠的TNF-α和IL-6及NO水平較sham組明顯升高(P<0.01)，cir_6h組變化更明顯(P<0.01)，阿托伐他汀處理后NO、TNF-α和IL-6水平明顯降低(P<0.01)，見圖5、6。

#：P<0.01，與sham組比較；**：P<0.01。

#：P<0.01，與sham組比較；**：P<0.01。

2.6 阿托伐他汀對大鼠CIR后腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化標(biāo)志iNOS及eNOS的影響

cir_2h組iNOS mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05)，cir_6h組iNOS mRNA表達(dá)增加更為明顯(P<0.01)。與sham組比較，cir_2h組和cir_6h組eNOS mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。在阿托伐他汀處理后均能明顯改變iNOS、eNOS mRNA表達(dá)(P<0.01)，見圖7。

2.7 阿托伐他汀對大鼠CIR后腦組織NF-κB信號(hào)通路和IRF5的影響

cir_2h組和cir_6h組p-IκBα/IκBα、p-p65/p65、IRF5蛋白表達(dá)較sham組明顯升高(P<0.01)，在阿托伐他汀處理后p-IκBα/IκBα、p-p65/p65、IRF5蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)，見圖8。

#：P<0.01，與sham組比較；*：P<0.05，**：P<0.01。

#：P<0.01，與sham組比較；**：P<0.01。

3 討 論

CIR可導(dǎo)致嚴(yán)重腦功能受損，造成神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制與線粒體損傷、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)密切相關(guān)。近年來，有研究表明他汀類藥物能有效緩解CIR對腦造成的損傷作用，改善神經(jīng)功能，但其機(jī)制有待進(jìn)一步明確[10]。李玉竹等[11]發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀能有效地減輕大鼠在CIR后的神經(jīng)功能損傷，降低神經(jīng)功能損傷評(píng)分。本研究顯示，缺血再灌注的處理對大鼠神經(jīng)功能造成了損傷，增加了神經(jīng)功能缺損評(píng)分。隨著缺血時(shí)間的延長，對大鼠神經(jīng)功能的損傷程度也逐漸加重。而阿托伐他汀的處理組可有效地降低大鼠在CIR后的神經(jīng)功能缺損評(píng)分。且阿托伐他汀對cir_2h組相較cir_6h組神經(jīng)功能缺損評(píng)分差異更為明顯。這也表明，在缺血早期使用阿托伐他汀可以更好地保護(hù)CIR造成的腦損傷。通過對血腦屏障通透性的測定發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀處理能明顯降低CIR后腦組織中EB水平，表明阿托伐他汀的處理能維持血腦屏障的穩(wěn)定性，改善大鼠CIR后對血腦屏障的損傷。細(xì)胞間緊密連接是血腦屏障最主要的物質(zhì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，可阻止病原體和大分子物質(zhì)進(jìn)入腦脊液。賀涓涓等[10]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿托伐他汀處理能明顯降低大鼠在CIR之后腦組織中EB水平。類似地使用辛伐他汀的處理同樣也使得腦組織中EB水平明顯降低，且呈劑量效應(yīng)[8]。大鼠在CIR后腦含水率明顯升高，提示腦部存在水腫的情況，并且隨著缺血再灌注時(shí)間的延長，水腫更為嚴(yán)重，這與其他研究結(jié)果相一致[10]。這可能是因?yàn)檠X屏障的破壞使得大分子物質(zhì)經(jīng)細(xì)胞間隙進(jìn)入腦組織內(nèi)部，提高了腦組織滲透壓，導(dǎo)致腦水腫的發(fā)生。阿托伐他汀處理后，腦含水率明顯降低。這可能是由于阿托伐他汀能通過重建腦部血管內(nèi)皮之間的緊密連接，維持腦部滲透壓，減輕大鼠在CIR后的腦水腫。大鼠CIR后腦組織中的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)水腫的現(xiàn)象，這與腦含水率的測定結(jié)果一致，并且阿托伐他汀處理能在一定程度上減少腫脹的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量。隨著缺血時(shí)間的延長，神經(jīng)元還出現(xiàn)壞死的情況，李玉竹等[11]研究也發(fā)現(xiàn)阿托伐他汀可以減少大鼠在CIR后的神經(jīng)元損傷。

研究表明，CIR對腦尤其是神經(jīng)功能的損傷作用可能與NF-κB信號(hào)通路的活化導(dǎo)致的炎性反應(yīng)有關(guān)。NF-κB信號(hào)通路是調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的經(jīng)典通路，目前發(fā)現(xiàn)它能通過促進(jìn)IL-6和TNF-α等促炎癥因子表達(dá)，同時(shí)IL-6和TNF-α亦能激活NF-κB信號(hào)通路，加劇炎癥的惡化。研究還發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物能夠抑制NF-κB信號(hào)通路的活化，抑制促炎因子的釋放[12]。本文通過檢測NF-κB通路的關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)p-IκBα/ IκBα、p-p65/p65在CIR后有明顯升高(P<0.01)，NF-κB通路被激活。而阿托伐他汀能夠明顯抑制NF-κB信號(hào)通路的活化。IL-6和TNF-α的ELISA檢測結(jié)果也與p-IκBα/IκBα、p-p65/p65的變化趨勢一致。這也預(yù)示著大鼠CIR之后，NF-κB通路被激活，促進(jìn)了IL-6和TNF-α等促炎因子的表達(dá)，大量的促炎因子釋放和囤積對腦及神經(jīng)功能造成嚴(yán)重的損傷，而阿托伐他汀能抑制這一過程。鞠寧[13]研究表明，普伐他汀能抑制心肌缺血再灌注引起的家兔血清TNF-a及IL-6水平的升高，抑制心肌炎性反應(yīng)。上述研究結(jié)果表明阿托伐他汀能通過抑制NF-κB信號(hào)通路降低IL-6和TNF-α的合成，緩解炎性反應(yīng)所釋放的促炎因子對腦及神經(jīng)功能造成的損傷。

炎性反應(yīng)與巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)有著密切的關(guān)系，M1極化表型的巨噬細(xì)胞能夠釋放促炎因子，而M2巨噬細(xì)胞則與抗炎反應(yīng)和組織重塑反應(yīng)相關(guān)[14]。研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞同樣存在著極化表型變換。當(dāng)大腦損傷后，小膠質(zhì)細(xì)胞能夠向M1極化表型轉(zhuǎn)換，分泌促炎因子，對大腦造成損傷[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，M1極化標(biāo)志物iNOS mRNA表達(dá)在阿托伐他汀處理后明顯降低(P<0.01)，而eNOS mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.01)。研究證實(shí)，CIR會(huì)導(dǎo)致過量氧自由基NO的釋放，它可以與O2-或其他氧自由基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生更多的活性基團(tuán)，而iNOS和eNOS能夠耦聯(lián)調(diào)控NO的釋放[16]。本研究中，iNOS表達(dá)量的降低除了表明大鼠腦組織中M1極化小膠質(zhì)細(xì)胞的減少，同樣也提示氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)的減輕。說明阿托伐他汀的處理能緩解大鼠CIR后的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)水平。在阿托伐他汀處理后，大鼠腦組織中eNOS的增加也表明抗炎增強(qiáng)，抑制過量NO釋放，阿托伐他汀能在降低促炎因子釋放的同時(shí)，提高抗炎反應(yīng)，抑制氧化應(yīng)激水平，促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M2極化的改變。邢宏義[17]在小鼠腦缺血模型上的研究表明，羅蘇伐他汀通過增加eNOS的表達(dá)、抑制iNOS的表達(dá)而起到神經(jīng)保護(hù)作用。IRF5作為一種干擾素調(diào)節(jié)因子，在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化的過程中發(fā)揮著重要作用[18]。IRF5蛋白表達(dá)趨勢與NO和iNOS表達(dá)一致。故大鼠在CIR損傷后也刺激了IRF5蛋白表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化，并促進(jìn)了iNOS和NO的表達(dá)，但阿托伐他汀抑制了這一過程。谷祥任等[19]在研究小鼠巨噬細(xì)胞極性時(shí)也得出普伐他汀能降低IRF5基因的表達(dá)。

綜上所述，大鼠CIR后，表現(xiàn)出神經(jīng)功能缺損評(píng)分增加、血腦屏障通透性增加、腦水腫和腦神經(jīng)元壞死，而阿托伐他汀處理緩解了這些現(xiàn)象的發(fā)生。其機(jī)制一方面是通過抑制NF-κB信號(hào)通路活化，減少TNF-α、IL-6等促炎癥因子的分泌，抑制炎性反應(yīng)；另一方面，通過降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化調(diào)節(jié)因子IRF5表達(dá)，抑制M1極化，降低iNOS和NO的表達(dá)，并提高eNOS的表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，從而起到對神經(jīng)功能的保護(hù)作用。此外，相對于腦缺血的晚期而言，在CIR的早期使用阿托伐他汀對神經(jīng)功能的保護(hù)作用更明顯。