和厚樸酚通過(guò)上調(diào)TRAF3表達(dá)對(duì)類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞活化的影響*

呂昌偉，和 晶，張 乾，郗海濤，強(qiáng) 毅，張靜濤

(西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院骨科，西安 710018)

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種炎性自身免疫性疾病，病程長(zhǎng)、預(yù)后差、致殘率高，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[1]。然而，RA的發(fā)病機(jī)制目前仍不完全清楚，尚無(wú)有效的根治方法。類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS)在RA的病理發(fā)展中起到了重要作用[2]。研究表明，F(xiàn)LS的異常增生和活化，是導(dǎo)致RA患者滑膜增生、滑膜炎癥和軟骨損傷的重要原因[3-5]。活化的FLS發(fā)生過(guò)度增殖，并通過(guò)產(chǎn)生大量炎癥因子和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix met alloproteinase，MMP)，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-8、CXC趨化因子配體10(CXCL10)、MMP-2和MMP-9，募集和激活免疫細(xì)胞和關(guān)節(jié)細(xì)胞，觸發(fā)并維持關(guān)節(jié)的慢性炎癥和進(jìn)行性損壞[6]。

和厚樸酚(honokiol，HNK)是木蘭科植物厚樸中提取的主要藥效成分之一，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[7-8]。雖然治療RA的中醫(yī)驗(yàn)方中使用了厚樸[9]，但目前并無(wú)NHK對(duì)RA治療的研究。本研究探討HNK通過(guò)上調(diào)腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子3(TRAF3)表達(dá)對(duì)FLS活化的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

MH7A細(xì)胞株(日本Riken cell bank公司)；1%青鏈霉素、CCK-8試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；人重組TNF-α(BBI生命科學(xué)有限公司);RNAiso Plus、PrimeScriptRT Master Mix試劑盒、TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本TaKaRa公司)；細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)抑制劑MK-8353(MK)、HNK(美國(guó)MCE公司)；si-TRAF3(美國(guó)Santa Cruz公司)；人IL-6、CXCL10 ELISA檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；lipofectamin 2000、optiMEM(美國(guó)Invitrogen公司)；酶標(biāo)儀(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組

MH7A細(xì)胞株采用RPMI-1640培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素培養(yǎng)。對(duì)照(CON)組無(wú)處理，TNF-α(TNF)組采用5 ng/mL TNF-α處理24 h，TNF+HNK組、TNF+HNK+MK組、TNF+HNK+siTRAF3組分別采用5 ng/mL TNF-α分別復(fù)合10 μmol/L HNK、1 μmol/L MK或si-TRAF3干擾處理24 h，同時(shí)設(shè)立二甲亞砜(DMSO)溶劑對(duì)照。

1.2.2siRNA轉(zhuǎn)染

將si-TRAF3和si-CON同lipofectamin 2000溶解于optiMEM，室溫穩(wěn)定20 min制成轉(zhuǎn)染液。細(xì)胞用轉(zhuǎn)染液培養(yǎng)6 h，換回正常培養(yǎng)基，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

各組處理細(xì)胞結(jié)束后，采用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖。用正常培養(yǎng)基按照1∶9體積配制CCK-8溶液，每孔加入100 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h，于酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度。

1.2.4ELISA檢測(cè)IL-6、CXCL10表達(dá)

收取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用人IL-6、CXCL10 ELISA檢測(cè)試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行操作和檢測(cè)。

1.2.5Real-time PCR檢測(cè)TRAF3 mRNA表達(dá)

采用RNAiso Plus提取細(xì)胞總RNA，PrimeScriptRTMaster Mix試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用TB Green Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)，引物序列如下：TRAF3:forward 5′-ACA TCC GCC TAG CCG ACA TGG-3′，reverse 5′-CTG CTT CCG CCG CTT GTA GTC-3′；GAPDH：forward 5′-AGG TCG GTG TGA ACGGAT T-3′，reverse 5′-AAT CTC CAC TTT GCC ACT GC-3′，于CFX96 Real-Time System上機(jī)檢測(cè)。全部操作按照使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.6Western blot檢測(cè)TRAF3、MMP-2、MMP-9、p-ERK蛋白表達(dá)

RIPA裂解液收集細(xì)胞蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，加入4×Laemmli緩沖液，97 ℃加熱10 min。10% SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA轉(zhuǎn)至PVDF膜。分別孵育TRAF3一抗、MMP-2一抗、MMP-9一抗、ERK一抗、p-ERK一抗、β-actin一抗，4 ℃過(guò)夜，室溫孵育羊抗兔二抗。化學(xué)發(fā)光后，置于ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 HNK對(duì)MH7A細(xì)胞活化的影響

與CON組比較，TNF組細(xì)胞IL-6、CXCL10分泌明顯增加(P<0.05)，MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。TNF+HNK組細(xì)胞活力較CON組和TNF組明顯降低，且IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)較TNF組明顯降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

2.2 HNK對(duì)MH7A細(xì)胞TRAF3表達(dá)的影響

與CON組和TNF組比較，TNF+HNK組TRAF3 mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

2.3 TRAF3介導(dǎo)HNK對(duì)MH7A細(xì)胞活化的影響

與si-CON組比較，si-TRAF3組TRAF3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。TNF+HNK+siTRAF3組IL-6、CXCL10分泌和MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)較TNF+HNK組明顯升高(P<0.05)，見(jiàn)圖3。

2.4 ERK信號(hào)通路在HNK調(diào)控TRAF3表達(dá)中的作用

與CON組和TNF組比較，TNF+HNK組p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，TNF+HNK+MK組p-ERK1/2、TRAF3蛋白表達(dá)明顯低于TNF+HNK組(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

A：各組MH7A細(xì)胞增殖情況；B：各組細(xì)胞IL-6水平；C：各組細(xì)胞CXCL10水平；D：各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白印跡圖；E：各組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)；F：各組細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)；*：P<0.05，**：P<0.01，與CON組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與TNF組比較。

A：各組細(xì)胞TRAF3 mRNA表達(dá)；B：各組細(xì)胞TRAF3蛋白印跡圖；C：各組細(xì)胞TRAF3蛋白表達(dá)；*：P<0.05，**：P<0.01，與CON組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與TNF組比較。

A：各組細(xì)胞TRAF3蛋白表達(dá)；B：各組細(xì)胞IL-6水平；C：各組細(xì)胞CXCL10水平；D：各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9蛋白印跡圖；E：各組細(xì)胞MMP-2蛋白表達(dá)；F：各組細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)；*：P<0.05，**：P<0.01，與CON組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與TNF組比較；&：P<0.05，與TNF+HNK組比較。

A：各組細(xì)胞p-ERK1/2、ERK1/2、TRAF3蛋白印跡圖；B：各組細(xì)胞p-ERK1/2蛋白表達(dá)；C：各組細(xì)胞TRAF3蛋白表達(dá)；**：P<0.01，與TNF組比較；#：P<0.05，##：P<0.01，與TNF+HNK組比較。

3 討 論

目前，臨床治療RA的主要藥物包括糖皮質(zhì)激素和非甾體消炎藥，以及甲氨蝶呤等，而這些藥物往往不能實(shí)際緩解病情[10]。中藥用于RA治療具有悠久的歷史并多能緩解病情進(jìn)展[11]。中藥厚樸在治療RA的中藥復(fù)方中亦被廣泛配伍使用[9]，其中HNK是厚樸中主要有效成分之一，具有廣泛的抗炎活性[12]。FLS的異常活化在RA的發(fā)病中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[13-14]。本研究顯示，HNK可明顯抑制FLS的增殖，并抑制了TNF-α所致的促炎因子IL-6、CXCL10的分泌，以及MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)。提示HNK可有效抑制FLS活化，降低FLS增殖、炎性反應(yīng)和侵襲能力，其具有治療RA的潛在價(jià)值。

已有研究顯示，HNK可通過(guò)阻斷核因子(NF)-κB信號(hào)通路抑制炎性反應(yīng)，降低IL-6和MMP-9的表達(dá)[15]。但是，HNK抑制NF-κB信號(hào)通路激活的機(jī)制并不清楚。TRAF3作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的負(fù)性炎癥調(diào)控因子，其高表達(dá)可有效阻止NF-κB信號(hào)的激活[6,16]。NF-κB信號(hào)的激活可促進(jìn)FLS的異常活化[6]，誘發(fā)IL-6、MMP-2、MMP-9和CXCL10表達(dá)升高[17-19]。本研究顯示，HNK可上調(diào)TRAF3蛋白表達(dá)。因此，HNK可能通過(guò)上調(diào)TRAF3表達(dá)，抑制NF-κB激活，進(jìn)而抑制FLS活化。這些結(jié)果也與先前的研究一致，即TRAF3和NF-κB與細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和炎性反應(yīng)相關(guān)[6,20-21]。

HNK已在多個(gè)細(xì)胞內(nèi)被證明可以激活ERK1/2信號(hào)抑制細(xì)胞遷移，并引起細(xì)胞自噬和凋亡[22-23]。但HNK是否能通過(guò)激活ERK1/2信號(hào)，進(jìn)而上調(diào)TRAF3表達(dá)尚不清楚。本研究結(jié)果表明， ERK1/2信號(hào)激活介導(dǎo)了HNK對(duì)TRAF3表達(dá)的上調(diào)作用。前期有研究報(bào)道m(xù)iRNA-17-92靶向干擾TRAF3翻譯表達(dá)，引起了細(xì)胞遷移和侵襲能力的增強(qiáng)，并且導(dǎo)致了ERK信號(hào)的激活[24]，表明ERK信號(hào)和TRAF3之間可能存在雙向作用。

目前，RA的臨床治療仍面臨諸多問(wèn)題。本研究提示了中藥厚樸成分HNK對(duì)RA的潛在治療價(jià)值,對(duì)降低目前臨床藥物用量，減少并發(fā)癥提供了一種可能途徑。