miR-134靶向基質金屬蛋白酶1對喉癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響*

陳艷丹，岑瑞祥，曹 煒，龔國清，彭 聰

[鄂東醫療集團黃石市中心醫院(湖北理工學院附屬醫院)耳鼻咽喉頭頸外科，湖北黃石 435000]

喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，2014年我國喉癌發病2.34萬例(男性2.08萬例，女性0.26萬例)，其中死亡1.32萬例(男性1.15萬例，女性0.17萬例)[1]。由此可見，喉癌具有好發于男性、病死率高的特點。導致喉癌患者死亡的主要原因是局部復發和遠處轉移，目前對喉癌細胞遠處侵襲轉移的分子機制尚不清楚。基質金屬蛋白酶家族(MMPs)被認為是細胞外基質形成、重塑、細胞分化及成型等的重要調控介質，與腫瘤細胞增殖、侵襲、轉移和血管形成密切相關[2]。高通量測序分析顯示，基質金屬蛋白酶1(MMP1)在喉癌組織中普遍高表達[3]，但其具體調控機制未明。CHEN等[4]報道miR-134靶向負調控MMP1和MMP3抑制骨肉瘤細胞的侵襲和轉移，提示miR-134可能是MMP1表達的調控機制之一。因此，本研究探討miR-134靶向MMP1對喉癌細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響，以期為喉癌的診治提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

喉癌細胞系Hep-2和HEK293T細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；RPMI-1640培養基、胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素混合液(雙抗)和胰蛋白酶購自美國Gibco公司；脂質體lipfectamine 2000(Lip2000)和TRIzol購自美國Invitrogen公司；CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自日本同仁株式會社化學研究所；AnnexinⅤ-FITC/碘化丙錠(PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；Western blot全套試劑購自碧云天生物技術研究所；兔抗人MMP1單克隆抗體及鼠抗人GAPDH單克隆抗體(一抗)和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(二抗)均購自英國Abcam公司；miR-134 mimics、antagomir和WT MMP1 3′-UTR、Mut MMP1 3′-UTR質粒購自上海吉凱生物科技公司。雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自美國GeneCopoeia公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養及轉染

Hep-2細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養液，置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養，每2～3天常規傳代1次。轉染實驗分為miR-134 mimics組、miR-134 antagomir組和空白對照組，嚴格按照試劑盒說明書進行轉染。

1.2.2雙熒光素酶報告基因實驗

借助miRNA靶基因預測數據庫Targetscans，發現MMP1可作為miR-134的靶基因。為了驗證預測的MMP1是否為miR-134的目標靶基因，以及miR-134對MMP1蛋白表達的影響，進行雙熒光素酶報告基因實驗。按轉染試劑說明書分別將miR-134 mimics或mimics-NC與WT MMP1 3′-UTR和Mut MMP1 3′-UTR熒光素酶載體共轉染HEK293T細胞，轉染48 h后，檢測上述細胞的相對熒光強度。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖活性

收集轉染后的細胞，調整細胞濃度為1×105/mL，取100 μL細胞懸液接種于96孔板的1孔，做5個副孔。待細胞融合度達70%～80%時，向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，置于培養箱中繼續培養2～3 h，間斷觀察顏色變化，在波長450 nm處測量各孔的光密度值，以RPMI-1640培養基為空白對照組。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡

收集轉染48 h后的細胞，用預冷的PBS洗2次；加入300 μL的1×Binding Buffer重懸細胞，5 μL Annexin V-FITC搖勻，室溫，避光孵育15 min。隨后加入5 μL PI染色，混勻。然后再加入100 μL 1×Binding Buffer，上機檢測細胞的凋亡率。

1.2.5Western blot檢測MMP1蛋白表達

消化、收集細胞，RIPA提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE分離蛋白，將分離后的蛋白轉移至PVDF膜上；然后用含5%脫脂奶粉的TBST封閉液室溫封閉2 h；加入一抗[兔抗人MMP1和GAPDH單克隆抗體(體積稀釋比例均為1∶800)]，置于搖床上，4 ℃過夜，TBST洗膜3次；加入二抗[羊抗鼠IgG(體積稀釋比例為1∶1 200)]常溫條件下反應1 h，再用TBST洗膜3次，每次10 min；顯影，采用Image J測定條帶光密度，重復3次。

1.2.6Transwell法檢測細胞遷移和侵襲能力

細胞遷移能力：將轉染48 h后的細胞制成懸液，密度為1×104/mL。取100 μL細胞懸液加入Transwell小室上室，將600 μL完全培養基加入小室下室，培養24 h，甲醛固定，0.1%結晶紫染色，洗滌，拍照，高倍鏡下隨機取6個視野計數，取其均值，重復實驗3次。細胞侵襲能力：將 Martrigel基質膠按 1∶6稀釋后包被Transwell小室，4 ℃風干，37 ℃溫育凝固，其余步驟同上述細胞遷移能力檢測。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 驗證實驗

轉染miR-134 mimics的HEK293T細胞中，WT MMP1 3′-UTR報告載體的熒光素酶活性明顯降低，與轉染mimics-NC相比下降55.3%(P<0.01)；而miR-134 mimics 對Mut MMP1 3′-UTR報告載體的熒光素酶活性無明顯作用，見圖1。雙熒光素酶報告基因實驗結果與數據庫結果一致，miR-134能和MMP1的3′-UTR端結合。

1:miR-134 mimics;2:mimics-NC。

2.2 miR-134對喉癌細胞增殖和凋亡的影響

miR-134 mimics 組細胞在轉染后24 h的細胞活力明顯低于空白對照組(P<0.01)，而miR-134 antagomir組明顯高于空白對照組(P<0.05)，見圖2。與空白對照組凋亡率[(4.32±0.36)%]比較，miR-134 mimics組[(12.02±0.45)%]明顯增加(P<0.01)，而miR-134 antagomir組[(2.31±0.26)%]明顯降低(P<0.05)，見圖3。

2.3 miR-134對喉癌細胞侵襲和遷移的影響

與空白對照組比較，miR-134 mimics組的細胞侵襲和遷移能力明顯減弱(P<0.05)，miR-134 antagomir組的細胞侵襲和遷移能力明顯增強(P<0.05)，見圖4。

a：P<0.01，b：P<0.05，與空白對照組比較。

圖3 各組喉癌細胞凋亡情況

2.4 miR-134對MMP1蛋白表達的影響

與空白對照組MMP1蛋白表達比較，miR-134 mimics組明顯降低(P<0.05)，而miR-134 antagomir組明顯升高(P<0.05)，見圖5。

圖5 各組MMP1蛋白表達情況

3 討 論

腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移是多種因素參與，多步驟，腫瘤細胞自身與機體內外界復雜連續相互作用的結果，其調控網絡十分復雜。miRNAs是一類22～25 nt大小的非編碼單鏈RNA，靶向結合miRNA的3′UTR，導致其降解和(或)抑制翻譯，抑制靶基因蛋白表達。研究證據顯示，miRNAs是一種可促進癌癥發生或者抑制癌癥發生的基因調節關鍵因子，在控制細胞增殖、分化、凋亡、侵襲及遷移等生物學過程中發揮著重要的作用[5]。miR-134位于染色體14q32，在維甲酸誘導的小鼠胚胎干細胞分化過程中表達上調，調控干細胞相關轉錄因子的編碼序列，誘導小鼠胚胎干細胞的轉錄和形態學改變，從而產生新的表型[6]。越來越多的證據表明，miR-134通過多種方式參與頭頸鱗狀細胞癌發生、發展的調控過程，如miR-134靶向WWOX基因影響頭頸鱗癌細胞系(OECM-1、SAS和HSC-3)體外致癌性、腫瘤發生和轉移[7]，miR-134靶向PDCD7降低上皮鈣黏蛋白表達，加速口腔癌進展[8]。CHEN等[4]研究顯示，miR-134在體內外靶向MMP1抑制骨肉瘤細胞侵襲和轉移，這與本研究中的雙熒光素酶報告實驗結果一致，表明miR-134是MMP1轉錄過程中的調控因子之一。

在正常情況下，細胞外基質和細胞基底膜都受嚴格控制，在維持正常結構和生長進程中發揮著重要的作用。細胞外基質和細胞基質膜中MMPs的降解與惡性腫瘤的形成、生長、黏附、浸潤和轉移密不可分，這一過程是腫瘤細胞向周圍組織轉移的重要分子事件[9]。研究表明，MMPs蛋白表達異常與多種腫瘤晚期轉移有關，如肺癌[10]、結直腸癌[11]、乳腺癌[12]等。MMP1位于11q22.3，是MMPs的重要成員之一，它可以降解Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型間質膠原蛋白，為癌細胞侵入基質屏障和通過組織間質遷移掃清障礙[13]。差異表達分析顯示，MMP1在喉癌癌灶組織中高表達，與腫瘤生存率呈顯著負相關[3,14]，但MMP1在喉癌中的生物學作用不清。本研究表明，過表達miR-134，下調MMP1蛋白表達，減少細胞增殖活性，抑制侵襲和遷移，增加細胞凋亡率，這與miR-134/MMP1在骨肉瘤細胞中發揮的效應一致[4]。MMP1促進腫瘤發生的病理機制可能在于通過分解Ⅰ型膠原，參與腫瘤的侵襲和轉移[15]。

本研究對miR-134/MMP1在喉癌細胞中的作用進行了初步研究，然而存在以下不足之處：(1)未用臨床標本驗證已發表文獻MMP1在喉癌組織的高表達，且僅取1種喉癌細胞系進行了研究，今后應開展臨床研究和擴大細胞系，以驗證本研究結論和明確臨床意義；(2)miR-134/MMP1介導喉癌發生、發展的具體機制仍不清楚，后續應加強研究。

綜上所述，本研究發現miR-134是MMP1表達調控機制之一，miR-134/MMP1調控喉癌細胞基本生物學行為，為闡明其調控的分子機制提供了重要的證據，且為其防治提供了潛在的分子靶點。