葉酸對(duì)鋁誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性氧和線粒體膜電位水平的影響*

曾智東,戚傳嬌,周艷華,謝 春

(貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院/環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽(yáng) 550025)

鋁是人體的非必需元素，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)鋁可以引起學(xué)習(xí)記憶及認(rèn)知能力障礙[1-2]。MIRZA等[3]在一個(gè)家族性阿爾茨海默病人群中利用熒光鎵染色法發(fā)現(xiàn)了其前額葉皮層和頂葉皮層中的鋁聚集，并且還觀察到了β樣淀粉蛋白斑塊與鋁的共定位。在體外實(shí)驗(yàn)中,鋁能引起神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性氧(ROS)水平的升高,并能擾亂細(xì)胞天然的抗氧化系統(tǒng)[4]。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)鋁能夠穿過(guò)血腦屏障后分布到大腦皮層和海馬域，誘導(dǎo)產(chǎn)生氧化應(yīng)激并對(duì)膜脂、蛋白和抗氧化系統(tǒng)造成損傷[5-7]。在神經(jīng)系統(tǒng)中鋁元素的積累具有一定的毒性，而由鋁引起的氧化應(yīng)激可能是其產(chǎn)生毒性的一個(gè)重要手段。

葉酸也稱為維生素B9，是人體內(nèi)參與合成DNA和RNA的重要物質(zhì)，其主要來(lái)源于新鮮的蔬菜、水果和肉類。眾所周知葉酸可以預(yù)防新生兒的神經(jīng)管畸形，母體中的葉酸水平與新生兒神經(jīng)管畸形發(fā)病率密切相關(guān)，但葉酸是如何阻止神經(jīng)管畸形的發(fā)生過(guò)程還未明確[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，葉酸可以降低患者在進(jìn)行血液透析過(guò)程中的氧化應(yīng)激水平并增強(qiáng)血液的總抗氧化水平[9]，通過(guò)提高抗氧化能力及降低β樣淀粉蛋白的形成，葉酸能通過(guò)增強(qiáng)高血壓患者的心臟和血管中交感神經(jīng)感受器的靈敏度來(lái)緩解病情[10-11]。本研究探討葉酸對(duì)鋁誘導(dǎo)的人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞活性氧(ROS)和線粒體膜電位(MMP)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y細(xì)胞，中國(guó)科學(xué)院昆明野生動(dòng)物細(xì)胞庫(kù))；硫酸銅、硫酸亞鐵、硫酸鋅、氯化鋁 (美國(guó)Sigma公司)；麥芽酚、葉酸(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培養(yǎng)基[生工生物工程(上海)股份有限公司];胎牛血清(美國(guó)Gibco公司);Cell Counting Kit-8、ROS檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA)、MMP檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；流式細(xì)胞儀(Coulter Cytomics FC500，美國(guó)Beckman Coulter公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4～7 d傳代1次。

1.2.2金屬染毒

將氯化鋁和麥芽酚分別配成濃度為20 mmol/L和60 mmol/L的溶液，將兩種溶液等體積混合配制成終濃度為10 mmol/L的麥芽酚鋁溶液過(guò)濾除菌后待用，鋁離子染毒均使用相應(yīng)濃度的麥芽酚鋁(標(biāo)記為Al)；將硫酸鋅、硫酸銅、硫酸亞鐵利用去離子水分別配置成10 mmol/L溶液過(guò)濾除菌后待用，染毒分別用相應(yīng)濃度Zn、Cu、Fe表示。

1.2.3葉酸干預(yù)

在含有10%胎牛血清的DMEM/Ham′s F-12(1∶1)培養(yǎng)基中分別配置葉酸終濃度為50、100、150、200 μmol/L的干預(yù)培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基中加入染毒金屬母液后即用于處理細(xì)胞。

1.2.4細(xì)胞ROS水平檢測(cè)

按照105個(gè)/孔SH-SY5Y細(xì)胞接種到12孔板中，然后加入相應(yīng)濃度金屬染毒相應(yīng)的時(shí)間，每個(gè)染毒濃度和時(shí)間5個(gè)重復(fù)。根據(jù)說(shuō)明書配置ROS檢測(cè)熒光探針(DCFH-DA)工作液，染毒結(jié)束后收集所有重復(fù)孔的細(xì)胞，加入PBS洗滌1次，然后加終濃度為10 μmol/L的熒光探針(DCFH-DA)工作液500 μL并重懸細(xì)胞。37 ℃避光孵育30 min后加入PBS 2 mL洗2次，離心后加PBS 500 μL重懸細(xì)胞，加入流試管內(nèi)，立即上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)染毒處理收集2×104～4×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。(1)有報(bào)道顯示環(huán)境相關(guān)金屬(Zn、Cu、Al、Fe等)能在海馬、大腦皮層等組織細(xì)胞中參與Aβ的生成過(guò)程[11]，所以使用100 μmol/L葉酸與100 μmol/L Zn、100 μmol/L Cu、100 μmol/L Al、100 μmol/L Fe共同處理SH-SY5Y細(xì)胞24 h后測(cè)定該細(xì)胞中的ROS水平。(2)使用100、200、300、400、500 μmol/L Al分別染毒SH-SY5Y細(xì)胞6 h后測(cè)定該細(xì)胞的ROS水平。(3)分別使用50、100、200 μmol/L葉酸干預(yù)300 μmol/L Al 誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞6 h的ROS水平，對(duì)照分別有含有10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培養(yǎng)基(control)、50 μmol/L葉酸處理及10 μmol/L葉酸通路阻斷劑甲氨蝶呤(MTX)。

1.2.5細(xì)胞MMP水平檢測(cè)

按照105個(gè)/孔SH-SY5Y細(xì)胞接種到12孔板中，然后分別加入300 μmol/L Al、50 μmol/L+300 μmol/L Al處理6 h，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。根據(jù)說(shuō)明書配置MMP檢測(cè)熒光探針(JC-1)工作液，染毒結(jié)束后收集所有重復(fù)孔的細(xì)胞，加入PBS洗滌1次，用500 μL全培養(yǎng)基重懸，然后加熒光探針(JC-1)工作液500 μL顛倒混勻細(xì)胞。37 ℃避光孵育20 min后加入1 mL 預(yù)先4 ℃冷卻的JC-1染色緩沖液洗4次，離心后加JC-1染色緩沖液500 μL重懸細(xì)胞，加入流試管內(nèi)，立即上流式細(xì)胞儀激發(fā)光488 nm進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)染毒處理收集2×104～4×104個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)。

1.2.6細(xì)胞毒性測(cè)定

將2×104個(gè)/孔SH-SY5Y細(xì)胞接種到96孔板中，然后分別加入300 μmol/L Al、50 μmol/L葉酸+300 μmol/L Al處理24 h，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)。當(dāng)染毒完成后再加入100 μL完全培養(yǎng)基，向每孔加入5 μL Cell Counting Kit-8溶液充分混勻，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h,酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)定光密度(OD值)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 葉酸干預(yù)各環(huán)境相關(guān)金屬誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平

Zn、Al、Fe金屬離子誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞均會(huì)不同程度提高ROS水平，葉酸可抑制由Al、Fe金屬離子誘導(dǎo)的ROS水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。100 μmol/L Al誘導(dǎo)的DCF相對(duì)熒光值為141 080±92 424高于100 μmol/L葉酸+100 μmol/L Al組的DCF相對(duì)熒光值120 092±80 891，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

2.2 不同濃度Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平

隨著Al的濃度提高，SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平呈上升的趨勢(shì)，300 μmol/L Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞DCF相對(duì)熒光值為11 959±6 233高于control組的7 388±3 642，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。但400、500 μmol/L Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平卻未升高，見圖2。

A:control與葉酸處理流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖;B:Zn染毒及葉酸干預(yù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖;C:Cu染毒及葉酸干預(yù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖;D:Al染毒及葉酸干預(yù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖;E:Fe染毒及葉酸干預(yù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)峰圖;F:各金屬改變SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平及葉酸干預(yù)作用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果比較;a：P<0.05，與control比較；b：P<0.05，與單金屬處理組比較。

圖2 不同濃度Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平

2.3 不同濃度葉酸干預(yù)Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平

50 μmol/L葉酸+300 μmol/L Al組細(xì)胞的DCF相對(duì)熒光值為15 926±8 200低于300 μmol/L Al組的DCF相對(duì)熒光值20 118±12 503，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。單獨(dú)使用50 μmol/L葉酸處理并沒有大幅改變SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平，見圖3。

2.4 葉酸對(duì)Al誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞MMP的影響

300 μmol/L Al組MMP降低的細(xì)胞(即進(jìn)入A+-象限的細(xì)胞)比例為45.88%，而50 μmol/L葉酸+300 μmol/L Al 組為38.04%，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

2.5 葉酸對(duì)Al誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞毒性的影響

300 μmol/L Al組細(xì)胞存活率為71.9%，而50 μmol/L葉酸+300 μmol/L Al 組為82.7%，見圖5。

圖3 不同濃度葉酸干預(yù)Al誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞ROS水平

A:control;B:300 μmol/L Al;C:50 μmol/L葉酸+300 μmol/L Al;D:各組MMP降低細(xì)胞比例比較;a：P<0.05，與control比較；b：P<0.05，與300 μmol/L Al比較。

圖5 SH-SY5Y細(xì)胞的24 h增殖曲線

3 討 論

葉酸作為常用的水溶性維生素之一具有一定的抗氧化的能力。金莉莉等[12]研究發(fā)現(xiàn)葉酸可以降低小鼠體內(nèi)丙二醛(MDA)的水平，并且葉酸可通過(guò)升高血清中氧磷脂酶活性的同時(shí)降低髓過(guò)氧化物酶活性來(lái)發(fā)揮高密度脂蛋白的抗氧化和抗炎作用[13]。在臨床幽門螺桿菌陰性的慢性萎縮性胃炎治療中發(fā)現(xiàn)，增加葉酸的使用可提高患者的總抗氧化能力和谷胱甘肽氧化物酶活力，并降低患者血清中MDA的水平[14]。通過(guò)在子癇前期患者的治療中增加葉酸和維生素B12，可提高患者體內(nèi)超氧化物歧化酶和谷胱甘肽氧化物酶的活力，并降低MDA水平[15]。葉酸具有改善老年H型高血壓急性腦梗死患者認(rèn)知功能障礙的作用，在使用氯沙坦改善認(rèn)知功能障礙的同時(shí)加入葉酸能有效提高蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表和簡(jiǎn)易智能量表的評(píng)分，并降低神經(jīng)元特異性烯醇化酶、中樞神經(jīng)特異蛋白和Aβ等蛋白水平[16]。

阿爾茨海默病致病機(jī)制具有多種假說(shuō),而氧化應(yīng)激可擾亂機(jī)體氧化與還原的平衡，并使得身體產(chǎn)生過(guò)多的ROS和活性氮，促使Aβ在腦部的沉積[17]。已有研究提示ROS與阿爾茨海默病的發(fā)生有密切關(guān)系，可能是阿爾茨海默病形成的重要因素[18]。而鋁具有神經(jīng)毒性可以引起神經(jīng)細(xì)胞的死亡[19]，而ROS可以介導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡。Aβ作為阿爾茨海默病發(fā)生的另一個(gè)重要因素可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎性反應(yīng)[20]，而鋁的存在有利于Aβ的生成，并且鋁能降低機(jī)體清除氧自由基的能力，加速機(jī)體的氧化損傷[21]。

本研究發(fā)現(xiàn)，Al可以在較短時(shí)間內(nèi)(6 h)誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的ROS水平上升，而葉酸可以在一定范圍內(nèi)降低Al所誘導(dǎo)的這種效應(yīng)。雖然已有研究顯示葉酸有一定的抗氧化功能[22]，但其是如何發(fā)揮抗氧化功能的還未有研究。而且ROS水平的上升可能導(dǎo)致細(xì)胞的線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放，并進(jìn)一步導(dǎo)致MMP的降低，使得細(xì)胞產(chǎn)生的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)數(shù)量降低，最后引起細(xì)胞的存活率降低[23]。本研究顯示，葉酸能降低Al對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的毒性，減少Al誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞MMP降低的細(xì)胞比例，推測(cè)葉酸可能通過(guò)拮抗鋁所誘導(dǎo)的ROS水平上升而促進(jìn)MMP的恢復(fù)，這為后續(xù)研究葉酸抗氧化機(jī)制提供參考。