水稻白化轉綠葉色突變體研究進展

唐輝武，張 蘭，蔡培榮，黃瀟溢，秦銀嬌，吳梓鵬，朱嘉慧，王麗敏

（仲愷農業工程學院現代種業創新研究院，廣東 廣州 510225）

大量研究預測，至2050年，全球人口將由目前的73億增加至97億，人們的生活不斷富庶，飲食結構逐漸改變，優質的動物食品及奶制品需求激增，這將需要生產大量的初級食品，全球糧食需求將會是現在的2倍以上［1-3］。水稻是主要的糧食作物之一，全世界超過50%的人口（我國超過60%的人口）以水稻為主食［4］。通過提高光合效率增加生物量是提高水稻單位面積產量的有效途徑，而光合作用效率與葉綠體的功能和活性密切相關［5］。葉色變異是一種常見的突變性狀［6］，葉色突變體是研究葉綠體發育和調控的良好材料。水稻白化轉綠突變體是葉色突變中比較特殊的一類，水稻苗期葉片中缺乏葉綠素，表現出白化現象，但植株生長發育到一定時期又能正常合成葉綠素，其失綠的葉片又逐漸恢復綠色，最終表現為正常綠色，因此將其定名為白化轉綠突變體［7］。階段性的白化轉綠現象源于非致死的葉色突變，主要表現為苗期白化［8-9］，與黃化突變相比較，白化突變體在苗期更加容易鑒定，因此在圖位克隆和后續實驗驗證等方面具有較大的優勢［10］。基于分子生物學的快速發展，目前已經通過定位或基因克隆等方法鑒定到多個控制白化轉綠性狀的基因［11-12］。隨著對植物葉色突變體的研究和認知的加深，其潛在的價值逐漸被發掘，很多植物葉色突變體已廣泛應用到基礎科學研究和實際生產中。本文從白化轉綠突變體的表型、分類、來源、作用機制、遺傳方式及應用等方面綜述了近年來關于水稻白化轉綠突變體的研究進展，為研究水稻葉綠體的發育、光合作用機制等理論研究以及雜交育種等實際應用提供參考。

1 白化轉綠突變體的表型及分類

白化轉綠突變體是對具有白化轉綠性狀的統稱，并不是所有的性狀都是嚴格的白化轉綠表型，只是具有這種共同的表型變化趨勢或過程，突變體白化轉綠的過程和轉綠的程度也不盡相同。正是因為有此特點，才使得不同類型的白化轉綠突變體均具有理論和實際研究的價值。

1.1 白化轉綠突變體表型

樓玨等［13］對水稻白化轉綠突變體標8S的研究表明，其在第1～4葉邊緣表現為失綠，其中第1、2葉白化面積較大，而第3、4葉逐漸減少，在第5葉基本恢復綠色。王軍等［14］對水稻白化轉綠突變體v13（t）進行研究，發現其在3葉期前都表現為白化，只有葉尖和葉鞘有少量綠色，在4葉期初開始轉綠，到第6葉時幾本恢復正常綠色。金怡等［15］發現了1個在生長初期葉色表現為白條紋、而至抽穗期其穗部表現為白化的水稻突變體wslwp，其在1葉期時葉色表現為白化，至2葉期以后的新生葉由中脈開始逐漸轉綠。蔡海亞等［16］鑒定到1個由GRA3控制的水稻白化轉綠突變體，該突變體在2葉期到4葉期間葉片邊緣白化，4葉期后轉綠。鄒金財等［17］發現了水稻階段性溫敏白化轉綠突變體stgrɑ254，該突變體在大田種植條件下，第1～5葉呈正常綠色，第6葉完全展開時近中部開始出現橢圓形小白斑點，在分蘗盛期逐漸融合成大白斑點，后漸漸轉綠，直至成熟期呈現正常綠色。

1.2 白化轉綠突變體分類

白化轉綠突變體的分類方法很多，沒有統一的標準。根據不同表型的葉色特點將突變劃分為單色突變、雜色突變和漸變突變［18］；根據白化轉綠后葉片的顏色差異，可劃分為白化轉淺綠、白化轉綠和白化轉黃綠突變體［19］；根據所缺失的色素類型，可劃分為caro缺乏型和chlb缺乏型［20］；根據突變表型對光周期、營養等環境因子的敏感特性，可劃分為光敏型和營養敏感型，光敏型又分為光照強度敏感型和光周期敏感型［21］；根據水稻白化轉綠突變體葉色表達與溫度的關系，可劃分為高溫敏感型、低溫敏感型和溫鈍型3種［22］；根據突變基因類型，又可劃分為核基因和胞質基因控制兩種類型［21］。一般而言，研究者會根據所獲得的白化轉綠突變體的特點進行分類。

2 白化轉綠突變體來源

植物出現葉色突變的原因多種多樣，其中自然突變和人工誘變是水稻白化轉綠突變體的主要來源。

2.1 自然突變

自然突變是指在沒有任何人為干預的自然條件下形成的突變，但突變概率較低且不易被發現。即使得到了可進一步研究的突變體，也需要利用圖位克隆法定位該自發突變的基因，利用該方法定位突變基因時間長且難度較大，因此存在一定的局限性［6］。日本科學家發現了virescentl-12系列自然突變的白化轉綠突變體，并對其中的v1、v2、v3、v9、v10、v11作進一步的深入研究［23-26］。Chen等［27］在粳稻品種秋豐（Qiufeng）中，發現了自然突變產生的白化轉綠突變體Qiufeng M。鄧鋒林等［28］在水稻花培后代中發現一種苗期葉片白化而隨著生長發育葉片轉綠的突變體，將該突變性狀轉入溫敏不育系培矮64S中育成白化轉綠突變體白02S。該性狀可作為一種形態標記性狀應用于水稻雜交種子和不育系純度的苗期快速鑒定。因自然突變不涉及基因編輯，在實際應用中更具安全性，但自然突變往往比較少。

2.2 人工誘變

物理誘變、化學誘變和基因操作技術誘導突變是最常使用的人工誘變方法。人工誘變的優點在于可以大幅度提高突變率，加快新品種選育的進程，并創造出新的種質資源；缺點是無法控制突變的方向。

物理誘變指利用物理因素如輻射、離子束、激光和衛星搭載等方式處理植物種子、花粉及根尖等使其產生突變的方法。化學誘變是指通過化學誘變劑處理產生的突變，常見化學誘變劑的種類有堿基類似物及相關化合物、烷化劑和其他種類的誘變劑，其中以烷化劑甲基磺酸乙酯（EMS）應用最為普遍。通過理化因素誘變可以在較短時期內獲得大量突變體，而其中的葉色突變目前已廣泛應用于植物育種工作中，并取得了很大的成就。浙江大學原子核農業科學研究所已建立一套利用60Co-γ輻射誘變培育白化轉綠突變體的技術，先后育成了白豐A等帶葉色標記的不育系［29］。夏英武等［30］用60Co-γ射線處理水稻溫敏核不育系2177S，獲得了一批常見的葉色突變體材料。

利用基因操作技術對生物體基因組特定目標基因進行修飾是較為精準的一項技術，通常使用基因沉默、插入突變等方式進行基因修飾。基因沉默突變是利用基因表達調控技術使某些基因失活而產生突變。Liu等［31］利用該技術從轉基因水稻株系中分離篩選得到1個對溫度敏感的突變體，當溫度高于26 ℃時，該突變體會出現白化轉綠的表型。基因沉默導致的葉色突變體多被用于研究特定基因的功能。插入突變是利用T-DNA、轉座子（Ac/Ds系統）、逆轉座子（Tos17）等元件插入到植物基因組中誘發突變。楊轉英等［32］運用T-DNA插入突變從變異群體中選育了一系列白化轉綠突變株系。何旎清等［33］在水稻品種‘Dongjin’的T-DNA插入突變體庫中篩選到1個不受溫度影響的黃綠葉突變體。隨著基因工程技術的飛速發展，通過基因工程操作的方法獲得大量葉色突變體越來越容易，但對于其分子機理的研究仍需不斷探索。

3 水稻白化轉綠分子機制

一般情況下，植物葉色突變會對光合作用產生影響，進而影響植物的生長發育，情況嚴重時，甚至引起植株死亡。葉色變異的發生與色素的合成和降解、葉綠體發育、核質信號轉導等因素密切相關［34］。水稻白化轉綠突變的產生機制主要由光合色素生物合成途徑中的基因突變、葉綠體發育過程相關基因突變以及質－核信號傳導途徑受阻等調控［12］。

3.1 光合色素生物合成途徑中的基因突變

葉綠體的發育和光合色素的合成是水稻白化轉綠的重要條件之一，受外界因素影響較大。高等植物葉片中的光合色素主要包括葉綠素和類胡蘿卜素。光合色素是由多個類異戊二烯組成的萜類化合物，類異戊二烯的合成途徑之一質體MEP（2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphate，MEP）途徑中編碼任意一個酶的基因發生突變，都會影響植物葉綠素及類胡蘿卜素的合成，進而影響葉綠體發育，引起葉色變異［35］。

3.1.1 葉綠素合成途徑中的基因突變 葉綠素主要以Chla和Chlb的形式存在于高等植物中。葉綠素的合成過程比較復雜，需要多種不同的酶參與協作才能完成。在這個過程中，任何一個基因發生變化，都可能對葉綠素的合成產生一定的影響，進而導致植物的葉色發生一定的變化［32］。Zhang等［36］研究發現，水稻中編碼Mg2+螯合酶相關基因發生突變，會引起該螯合酶活性下降，進而葉綠素合成量減少，葉色發生變化。Wu等［37］通過對葉綠素合成相關基因YGL1的研究，發現YGL1突變會導致葉綠素合成酶活性降低，進而延緩葉綠素的合成。Lee等［38］研究發現OsCAO1/2基因發生突變會影響chlb的合成，導致葉片出現白化、株高變矮等現象，嚴重時還會引起植株早衰死亡。水稻白化轉綠突變體w1在低溫環境下，葉綠素合成卟啉原形成部位受阻，導致水稻葉片出現白化；當溫度高于23 ℃時，w1的葉綠素合成逐漸恢復正常，葉色隨葉綠素含量增加逐漸轉綠［39］。WSL9編碼HNH核酸內切酶，低溫條件下在轉錄水平上影響葉綠素的合成［40］。ASL4編碼30S核糖體蛋白S1，該基因突變后影響葉綠素和類胡蘿卜素的合成，導致葉片白化［41］。

3.1.2 類胡蘿卜素合成途徑中的基因突變 類胡蘿卜素是植物光合色素的重要組成部分，包括胡蘿卜素和葉黃素，在光合作用中吸收和傳遞光能［42］。研究表明，OsLCY編碼番茄紅素β-羥化酶，當其缺失時會導致轉錄提前終止，類胡蘿卜素的合成受阻，植株葉色出現白化現象。OsPDS編碼八氫番茄紅素脫氫酶，當外顯子插入錯誤導致轉錄提前終止，水稻葉色也出現白化現象［43］。OsCRTISO編碼類胡蘿卜素異構酶，發生錯義突變后，水稻葉片白化［44］。編碼類胡蘿卜素合成途徑中的酶基因突變會導致類胡蘿卜素合成受抑制，進而出現葉片白化的表型。

3.2 葉綠體發育過程中的相關基因突變

綠色植物進行光合作用主要依賴于葉綠體。葉綠體的發育受核基因組與葉綠體基因組協調表達調控，葉綠體基因的表達變化會引起核基因組發生相應的變化，調控相關基因的表達，進而導致葉色發生突變［45］。水稻白化轉綠突變體v1中，OsRpoTp編碼葉綠體RNA聚合酶，該基因發生突變會導致葉綠體發育不正常，導致植株出現白化［46］。ASL1編碼葉綠體核糖體蛋白S20，該基因發生突變會導致控制相關葉綠體蛋白合成的核基因表達異常，使得水稻在苗期呈現白化表型［47］。參與葉綠體發育的GRA（T）基因編碼葉綠體蛋白合成延伸因子Tu（EF-Tu），其突變體在出苗時開始表現為白化，三葉期前葉片邊緣白化，隨后開始逐漸恢復綠色［48］。Zheng等［49］通過EMS誘變獲得苗期白化突變體rɑ1，通過圖位克隆發現RA1編碼氨酰-tRNA合成酶，該基因突變導致葉片的葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低，葉綠體發育異常，在苗期2周內表現為葉片白化。TSCD11編碼絲氨酸-tRNA合成酶，其突變體在25 ℃條件下生長與野生型無差別，溫度高于35 ℃，葉片出現白化，葉綠素和類胡蘿卜素含量顯著降低［50］。

3.3 核-質信號傳導途徑障礙

細胞核與葉綠體基因組間的核-質信號傳導途徑在葉綠體發育以及光合作用過程中均有重要作用，如果該途徑受到阻遏，會抑制光合色素的合成，這種改變可以作為信號分子傳遞，使相關核基因的表達得到一定的調節，從而導致葉色變異［18］。低溫條件下，水稻白化突變體v2中參與質體轉錄和翻譯的基因OsRpoTp和OsSIG2A過量表達，導致光合作用相關基因的表達受到抑制，進一步分析表明，在葉綠體分化早期，質體基因的轉錄和翻譯受到抑制，導致核質基因交流受到抑制，葉片出現白化現象［25］。Liu等［51］發現多效發育缺陷基因（PDD）的等位基因發生變異后，會影響葉綠體基因的表達，進而影響葉綠體和細胞核之間的信號傳導，使得突變體在五葉期前表現白化。

4 白化轉綠突變的遺傳方式

水稻的葉色突變主要受細胞核基因、細胞質基因以及核質基因互作調控。

4.1 細胞核遺傳

研究發現，由細胞核基因突變引起的葉色突變主要由隱性核基因控制，且遵循孟德爾遺傳規律。李瑞清等［21］通過研究發現，突變體g9和葉色正常的品種進行雜交得到的F2代群體的性狀分離比符合3∶1的理論分離比，g9的葉色突變受1對隱性核基因控制。楊海蓮等［52］通過遺傳分析發現，水稻突變體ygl10性狀受控于1對隱性核基因。劉喜等［53］利用水稻葉色白化轉綠突變體wgl與‘日本晴’、‘越光’雜交構建F2群體，遺傳分析發現該突變性狀也受控于1對隱性核基因。目前由隱性核基因控制水稻葉色突變體的報道較多［16,28,33,35,54］。

4.2 細胞質遺傳

細胞質遺傳往往受核基因的影響和控制，但一些半自主性細胞器（如葉綠體和線粒體）可以獨立地遺傳和編碼相關的遺傳物質和蛋白質。細胞質遺傳通常不遵循孟德爾遺傳規律，大多通過母性遺傳進行。細胞質基因引起的葉色突變較少，最早的報道見于Palmer等［55］對大豆的研究。劉友杰［56］采用激光誘導的方法獲得水稻褪綠突變體，通過對該突變體進行遺傳分析，發現該突變體由細胞質基因突變引起。

4.3 核質基因互作

核質互作通常被理解為核基因組與細胞質基因組間存在互相作用。一方面，核基因控制質體的發育，例如水稻核基因OsDVR［57］發生突變后，抑制了水稻葉綠體的發育，導致植株出現黃綠葉；另一方面，產生于葉綠體的信號系統也稱為逆行信號，該系統傳輸葉綠體發育和功能信息到細胞核，進而影響核基因表達［58］。V2編碼1個新型鳥苷酸激酶（GK），在葉綠體發育過程中參與信號向細胞核傳導，該基因的突變體v2屬于溫度依賴型突變體，在一定溫度條件下突變體喪失質體基因的特異表達性，抑制了核基因組編碼質體蛋白的表達，導致質體蛋白喪失翻譯功能，葉綠體分化受阻，呈白化表型［25］。Xu等［59］在水稻中克隆了編碼1個3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸轉運蛋白的基因PAPST1，該基因突變導致葉片發育早期表現枯黃，進一步通過亞細胞定位等試驗推測該基因可能作為3'-磷酸腺苷5'-磷酰硫酸載體，在細胞核和葉綠體之間起到信號傳導作用。目前核質基因互作是研究的熱點，其中機理仍有待探索。

5 影響水稻葉片白化轉綠的因素

高等植物葉綠體的發育一般分為3個階段：第一階段是質體DNA的復制及質體的分裂；第二階段是葉綠體遺傳系統的建立；第三階段是核-質基因高效表達引導葉綠體光合系統的合成與裝配，核基因編碼的 RNA聚合酶（nuclear encoded RNA polymerase,NEP）在葉綠體發育早期大量合成，之后受到抑制，此時質體編碼的RNA聚合酶（plasmid encoding RNA polymerase，PEP）開始活化，葉綠體發育完成［60］。葉綠體的發育涉及激活大量相關核基因和葉綠體基因，到目前為止其調控網絡尚未完全清晰。影響水稻白化轉綠突變體葉色變化的內因主要是相應的核基因和葉綠體基因，外因主要是溫度、光照等環境因素及氮代謝等。

5.1 溫度、光照等環境因素

溫度對水稻白化轉綠突變體的表型有重要影響，而且不同的突變體表現出的反應存在差異。常見的溫敏核不育系葉色突變類型有3種：低溫表達型、高溫表達型和溫鈍型［22］。低溫敏感型的水稻白化轉綠突變體白01S、w1、v13（t）、v1、v2等表現為低溫白化，在高溫條件下轉綠［35］。這是由于在低溫條件下，合成光合色素的相關酶活性降低，酶促反應受到抑制，導致相關蛋白合成速率慢，甚至無法合成，從而形成白化葉［25］，例如董華林等［61］研究發現突變體gr在20 ℃時葉片出現白化并停止生長。高溫敏感型突變體w4和w11等在30～35 ℃的溫度下葉片出現白化，但在20～25 ℃時葉片卻表現為黃化。溫鈍型突變體對溫度鈍感，其白化轉綠主要依靠水稻生育進程的發展［25］。目前已有相關研究表明，多數轉綠型水稻葉色突變體的轉綠受到溫度、生育進程或二者的共同調控，溫度對細胞內的酶促反應影響很大，一般認為高溫脅迫下植株葉綠素含量的響應方向或幅度與增溫階段或強度有關［62］。水稻階段性溫敏白化轉綠突變體stgrɑ254的生長發育和外界溫度一起調控著該突變體的表型［17］。光是葉綠體發育的必要條件。光照條件下，1/3的核轉錄受到影響，包括許多編碼葉綠體靶向蛋白的轉錄［63］。光照也是影響植物光合作用的重要因素，某些葉色突變體對光周期具有敏感性，突變體v3在白天（30 ℃、光照12 h）、夜晚（20 ℃、黑暗12 h）的條件下，葉片表現為正常的綠色［23］，溫度和光周期協同控制葉色的變化。

5.2 氮代謝

碳氮代謝的變化直接影響植物光合作用產物的形成、轉化和蛋白質的合成等，是植物的基本代謝過程。氮是葉綠素分子的重要組成部分，葉片中的氮含量會影響葉綠素的合成及葉綠體的發育，進而影響植株的光合作用，導致植株出現黃化或者白化的現象［64］。在缺氮的條件下，植物體內的葉綠素含量隨著氮含量的增加而增加，葉色相應發生變化［65］。Zhou等［66］研究發現，施氮程度的差異會促使水稻葉綠素含量發生相應的轉變，進而影響葉色。關于常規水稻氮代謝的研究較多，而關于白化轉綠突變體白化階段的氮代謝研究較少，利用白化轉綠突變體，白化轉綠階段的變化來研究水稻的氮素調控是很好的材料。

5.3 其他因素

植物葉片是響應脅迫的重要場所，一些白化轉綠突變體會應對脅迫反應產生表型變化。水稻白化突變體Oslcd1對鹽脅迫和干旱脅迫敏感［68］。劉喜等［53］發現水稻白化轉綠突變體wgl在3葉期葉片的超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性比野生型明顯增加，過氧化氫酶（CAT）活性明顯降低，且丙二醛（MDA）含量明顯增加，說明wgl在3葉期受到一定程度的氧化脅迫，葉色白化轉綠的過程也隨之受到影響。

6 應用與展望

葉綠體是植物光合作用的主要場所和細胞的能量供應中心，對植物的生長發育和細胞的新陳代謝至關重要［68］。葉綠體由自身基因組編碼的基因約有100個對質體蛋白的合成和光合作用起到重要作用，此外，還有超過3 000種由核基因編碼并定位到葉綠體的蛋白參與葉綠體的發育和光合作用的調控［69-70］。因此，葉綠體的發育高度依賴細胞核基因和葉綠體基因的協調控制［71-72］。由于細胞核和葉綠體基因之間復雜的相互作用，一些關鍵調控網絡中的基因突變將影響葉綠體發育，導致葉色突變，甚至引起植株死亡［73］。非致死的葉色突變體常被用作探究葉綠體發育、葉綠素生物合成及植物光合作用機制的重要材料，目前通過葉色突變體已鑒定和克隆到多個調控葉綠體發育的關鍵基因。由于葉色表型明顯、遺傳穩定、調查便捷，水稻葉色突變體還可作為表型標記應用于雜交稻育種［6］，不僅可以測定種子純度，還可以在苗期去除因受到外源花粉污染的種子和假雜種［28］，極大程度上減少了目標種子純度的鑒定時間，大大提高了育種效率。葉色突變還可應用于品種改良和功能基因組學等研究。

利用水稻葉色突變體還可以培育出具有觀賞價值的水稻品種，提高水稻的經濟價值；或將突變葉色基因轉移至其他觀賞類植物中，創造觀賞植物新品種。在水稻中已有很多白化突變體的發現和研究，盡管導致葉綠素缺乏的原因各異，但許多白化突變體在生理特性和細胞學水平上表現出一定的一致性或相似性［11］。目前關于水稻白化轉綠突變體的研究多集中在表型鑒定、遺傳分析及精細定位方面，雖然已鑒定多個控制水稻白化轉綠的基因，但其生物學功能和其下游的調控網絡并不十分清晰，這些基因是如何調控葉綠體結構和發育的還有待深入解析，進一步闡明白化轉綠的分子機理對葉綠體的發育調控的理論研究及遺傳育種的生產應用均具有重要意義。