膠孢炭疽菌侵染橡膠樹葉片染色方法的建立及顯微觀察

龍明滕，梁曉宇，杜艷楠，鄒麗君，張宇，王萌

摘? 要：本研究建立了一種橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色方法，通過顯微觀察明確膠孢炭疽菌在橡膠樹葉片中的侵染結構，為橡膠樹炭疽病的預測預報提供理論依據。在脫色劑（0.15%三氯乙酸乙醇溶液∶氯仿=5∶1）處理12 h，1%剛果紅染色劑抽濾染色3 h的條件下，能清晰觀察到膠孢炭疽菌在橡膠樹葉片上的發育進程和侵染結構。結果表明，在28 ℃、100%相對濕度培養條件下，接種橡膠樹淡綠期葉片2～6 h為分生孢子萌發高峰期，12 h后分生孢子萌發率大于85%;8～12 h為附著胞形成高峰期，接種12 h約75%的芽管頂端產生附著胞，少數附著胞中央部位開始形成侵染釘;24 h為侵染釘形成高峰期，同時分生孢子萌發形成多個芽管;36 h時附著胞頂端再次萌發產生次級附著胞，從而進一步侵染周圍細胞，葉片出現零星病斑;48 h時芽管不斷分支異化成菌絲并產生次級分生孢子，葉片出現大量典型的炭疽病病斑;72 h后菌絲在葉片表面縱橫擴展，隨機分支，逐步形成網狀分布。隨著菌絲的擴展，葉片組織發生一系列的病理變化，侵染部位組織出現褐色壞死病斑。本研究建立了一種著色效果好，簡便易行，經濟有效的橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色方法，進一步明確了膠孢炭疽菌的侵染結構。

關鍵詞：橡膠樹;炭疽病;膠孢炭疽菌;染色方法;侵染結構

中圖分類號：S763.7? ? ? 文獻標識碼：A

Establishment of Staining Method and Microscopic Observation of Rubber Tree Leaves Infected by Colletotrichum gloeosporioides

LONG Mingteng1， LIANG Xiaoyu1，2， DU Yannan1， ZOU Lijun1， ZHANG Yu1，2*， WANG Meng1，2*

1. School of Plant Protection， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Key Laboratory of Green Prevention and Control of Tropical Plant Diseases and Pests， Ministry of Education， Haikou， Hainan 570228， China

Abstract： The infection structures of Colletotrichum gloeosporioides on rubber trees would be clarified through microscopic observation to provide scientific basis for the anthracnose prediction in rubber trees. After rubber trees leaves treated with decolorizing agent （0.15% trichloroacetic acid-ethanol solution∶chloroform， 5∶1） for 12 h and 1% Congo red staining agent for 3 h， the developmental process and infection structure of C. gloeosporioides infection were clearly observed. Under the inoculation condition of 28 ℃ and 100% humidity， the crest-time of conidial germination was within 2-6 h after inoculated in rubber tree leaves at the light green phase. More than 85% of conidia were germinated after 12 h inoculation. The crest-time of appressorium formation was within 8-12 h after inoculation. About 75% germ tubes generated appressoria and appressoria began forming infection pegs after 12 h inoculation. The crest-time of infection pegs formation was at 24 h inoculation， while several germ tubes formed at the other top of the germinal conidium. The appressorium germinated to produce secondary appressorium， which further infected surrounding cells and caused leaves sporadic lesions at 36 h inoculation. After 48 h inoculation， Germ tubes of abundant branched differentiated into hyphae， some of which produced secondary conidia on the top. A large number of typical anthracnose spots formed. The hyphae spread vertically and horizontally on the leaf surface and gradually formed a net-like distribution after 72 h inoculation. As the hyphae expanded， a series of pathological changes occurred in the leaf tissue. In this study， a method for staining C. gloeosporioides in rubber tree leaves with good staining effects， simplicity， and efficiency was established， which further clarified the infection structures of C. gloeosporioides.

Keywords： rubber tree; anthracnose; Colletotrichum gloeosporioides; staining method; infection structure

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.10.031

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）起源于亞馬遜河流域，后成功引進我國，成為我國天然橡膠的唯一來源，是我國重要的戰略資源[1-2]。然而在天然橡膠生產過程中，病害一直是制約產量的重要因素。由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起的炭疽病是橡膠樹的重要病害之一[3]，可侵染橡膠樹嫩葉、葉柄、嫩梢等多個部位，危害苗圃小苗、大田幼樹直至成齡開割膠樹，引起嫩葉脫落、嫩枝干枯等，導致開割延遲，造成重大產量損失。關于橡膠樹炭疽病的研究，國內外學者對病原菌分類、生物學特性[4]、群體遺傳分析[5]、致病機理[6]、基因表達調控[7]、防治藥劑篩選[8]等方面進行了諸多研究，而關于侵染動態的研究只局限于離體疏水表面誘導橡膠樹炭疽菌發育分化過程[9]，該病原菌侵染橡膠樹葉片的顯微過程尚未報道。橡膠樹炭疽菌發育進程和侵染結構的顯微觀察是一項重要的組織病理學研究內容，組織染色法是研究葉部真菌病害的組織病理學侵染過程最為經典的方法，楊樹、草莓、洋蔥、芒果等植物炭疽病菌的組織染色方法已有報道[10-13]，但由于橡膠樹葉片有較厚的蠟質層和分泌乳膠的特點，這些方法對橡膠樹葉片真菌病害研究存在內部菌絲不易著色，染色時間長等缺點。常用的真菌染色方法有臺盼藍、苯胺藍、蘇木素-伊紅染色、高碘酸-無色品紅染色、六胺銀染色、改良革蘭氏染色等，這些染色方法存在染色時間不易把控、容易過染，病原菌與葉片組織對比不明顯且操作繁瑣等缺點[14-16]。Hoechst/Propidiu?mide雙熒光染色法能夠直接觀察病原菌在寄主組織中的位置，還能提供寄主細胞活力等信息，但熒光染色的高昂費用限制了其在田間病原菌檢測的大規模應用[17-18]。此外，熒光染色劑存在熒光淬滅現象，熒光強度持續時間不長，植物的自發熒光也會影響染色效果[19-20]。本研究將建立一種著色效果好，簡便易行，經濟有效的橡膠樹膠孢炭疽菌染色方法，對膠孢炭疽菌的發育進程和侵染結構進行顯微觀察，為進一步揭示橡膠樹炭疽病病害的發生發展規律，對掌握其病害流行規律及預測預報具有重要意義，同時可為該病害的有效防控提供科學依據。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 供試品種? 供試橡膠樹品系采自中國熱帶農業科學院橡膠研究所培育的巴西橡膠樹品種‘熱研7-33-97，種植于海南大學（儋州校區）試驗基地。

1.1.2? 供試菌株? 供試菌株為本實驗室分離純化并鑒定的橡膠樹膠孢炭疽菌（Colletotrichum siamense）菌株HN-23。

1.1.3? 供試藥劑? 臺盼藍、剛果紅購于北京索萊寶科技有限公司，苯胺藍購于上海麥克林生化科技有限公司，三氯乙酸和分析純試劑氯仿、乙醇等購自廣東光華科技股份有限公司。

1.1.4? 培養基? 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，加水定容到1000 mL，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖液體培養基（PDB）：不含瓊脂粉，其他同PDA培養基。121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2? 方法

1.2.1? 分生孢子懸浮液制備? 選擇PDA平板上生長4～6 d的炭疽菌菌落，用打孔器打取直徑為5 mm的膠孢炭疽菌菌碟，接入PDB培養基中，28 ℃搖培3 d至產生大量分生孢子，經4層無菌紗布過濾，12 000 r/min離心濃縮，棄上清液，加入適量無菌水，渦旋振蕩，搖勻，用血球計數板計數，制備濃度為106個/mL的分生孢子懸浮液備用。

1.2.2? 接種方法? 采集健康的不同時期橡膠樹葉片，用蒸餾水沖洗干凈，無菌水漂洗3次。用噴壺將分生孢子懸浮液均勻地噴到葉片表面，使液滴剛好滴下，接種后，將葉片放置于墊有濕潤紗布保鮮盒中，葉柄處包裹無菌水脫脂棉。置于28 ℃、相對濕度100%的人工氣候箱中培養。

1.2.3? 脫色劑組分與脫色時間優化? 采集古銅、淡綠、成熟3個時期的健康橡膠樹葉片，用蒸餾水沖洗干凈，無菌水漂洗3次。參考Knight等[21]的脫色方法，將0.15%三氯乙酸乙醇和氯仿按不同體積比（3∶1、4∶1、5∶1、6∶1）混合制成脫色劑，對橡膠樹葉片分別脫色5、10、12、15、20 h，將葉背面朝上置于載玻片上，水作浮載劑，用BDS400倒置生物顯微鏡觀察脫色效果。

1.2.4? 染色劑篩選? 取接種膠孢炭疽菌的淡綠期橡膠樹葉片，剪取1.5 cm × 1.5 cm的小塊樣品，采用張敬澤等[22]的染色方法，脫色后分別置于濃度均為1%的臺盼藍、苯胺藍和剛果紅水溶液中，真空抽濾至葉片不懸浮于染色液表面時立即觀察葉片染色效果，繼續靜置于染色劑中2 h，顯微觀察分生孢子染色效果。

1.2.5? 染色時間優化? 取接種膠孢炭疽菌的淡綠期橡膠樹葉片，脫色后置于1%剛果紅水溶液中，真空抽濾直至葉片不懸浮于染色液表面，分別靜置0.5、1、1.5、2、3、4 h，顯微觀察侵染結構。

1.2.6? 膠孢炭疽菌侵染橡膠樹葉片的癥狀及侵染結構觀察? 接種0、2、4、6、8、12、24、36、48、72、96、120 h的淡綠期橡膠樹葉片，觀察癥狀后采用上述最優染色條件進行染色，顯微觀察侵染結構。

1.3? 數據處理

參照萬三連等[23]的方法對試驗數據進行統計分析。統計孢子萌發率，計算附著胞形成百分率。附著胞形成百分率=形成各結構孢子數/孢子統計總數×100%。

2? 結果與分析

2.1? 脫色劑組分和脫色時間優化

通過對比發現，當使用的脫色劑中0.15%三氯乙酸乙醇溶液和氯仿配比為3∶1時，橡膠樹葉片組織脫色不徹底，配比為4∶1、5∶1、6∶1的脫色劑均有較好的脫色效果，但配比為6∶1的脫色劑需要較長的脫色時間。考慮氯仿屬于易制毒化學品，故最優脫色劑組分為5∶1的0.15%三氯乙酸乙醇溶液和氯仿（圖1）。最優組分脫色劑在脫色時間小于10 h時，古銅期葉片有色素殘留，不利于染色觀察。脫色20 h后葉片泛黃，底色不清，不利于染色觀察。脫色12～15 h時染色效果最理想，色素脫色完全，葉片呈白色。考慮到時效性，本研究選擇脫色時間為12 h。5∶1脫色劑脫色12 h，均能使橡膠樹古銅、淡綠、成熟3個時期的葉片脫色徹底，顯微觀察清晰。

2.2? 染色劑篩選

通過研究對比臺盼藍、苯胺藍、剛果紅3種染色劑對橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色效果，結果如圖2所示，臺盼藍和苯胺藍均能夠使孢子著色，但橡膠樹葉脈及葉肉細胞容易著色，干擾觀察視野。剛果紅能使孢子著色，染色效果極佳且不容易使橡膠樹葉脈及葉肉細胞著色，孢子和葉肉細胞區別明顯。綜合考慮操作難易程度、價格成本和毒性等因素，剛果紅染色劑更適用于橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色觀察。

2.3? 染色時間優化

為了清晰地觀察膠孢炭疽菌在橡膠樹葉片中的侵染結構，進一步優化了剛果紅染色劑的染色時間。結果表明，當1%剛果紅染色液處理時間低于2 h時，孢子、菌絲、芽管和附著胞均著色較淺，不利于發育進程和侵染結構的觀察（圖3A～圖3D）;染色3 h達到理想效果，能清楚地看到芽管和附著胞（圖3E）;染色4 h后著色效果沒有明顯的變化（圖3F），染色時間的延長導致染色劑的殘留。綜合考慮觀察的清晰度和染色效率，1%剛果紅染色液處理3 h更適用于橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的顯微觀察。

2.4? 膠孢炭疽菌接種橡膠樹葉片后侵染癥狀

將膠孢炭疽菌接種到橡膠樹葉片，持續觀察，發現接種36 h，葉片開始出現肉眼可見的褐色病斑（圖4B）。接種48 h病斑周圍開始褪綠（圖4C），接種72 h病斑逐漸擴大，葉片病斑顏色加深（圖4D）。接種96 h寄主組織壞死塌陷，最終在葉表面產生典型的褐色壞死病斑（圖4E）。接種120 h，在病斑周圍產生肉眼可見的白色絨毛狀菌絲（圖4F）。

2.5? 膠孢炭疽菌在寄主葉片上的發育進程及侵染結構的顯微觀察

膠孢炭疽菌分生孢子接種到橡膠樹淡綠期葉片2 h后，28 ℃、相對濕度100%條件下培養2 h，孢子萌發形成芽管（圖5B）。2～6 h為分生孢子萌發高峰期，接種12 h超過85%的分生孢子已萌發。4～8 h時孢子腫大，芽管頂端形成附著胞（圖5C）。12 h時約75%的芽管頂端產生附著胞，且多在寄主表皮細胞間隙或接近間隙處。少數附著胞在中央部位形成一個黑色的圓點，即侵染釘（圖5D），同時一個分生孢子可從不同部位萌發形成多個芽管，以提高病原菌侵染率（圖5E）。24 h時侵染釘數量達到高峰，分生孢子另一端萌發的芽管產生附著胞（圖5F）。36 h時附著胞頂端再次萌發產生次級附著胞，從而進一步侵染周圍細胞（圖5G）。48 h時芽管不斷分枝異化成菌絲并產生次級分生孢子（圖5H），72 h時菌絲在寄主葉表面縱橫擴展，隨機分枝，逐步形成網狀分布（圖5I）。

3? 討論

目前真菌侵染寄主植物的顯微觀察一般采用臺盼藍和苯胺藍作為染色劑進行組織染色[24-25]，但這2種染色劑容易出現過染現象，且均為致癌疑似物，對身體的傷害較大，不宜長期使用。另外臺盼藍常用于檢測細胞存活率的拒染試驗，只有細胞破損或者死亡，內部真菌才易著色，不適用于橡膠樹炭疽菌這類半活體營養侵染型真菌的早期檢測[26]。因此，本研究致力于開發一種適用于橡膠樹病原菌顯微觀察的染色劑及染色方法。在對橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色過程中，發現臺盼藍和苯胺藍容易染色橡膠樹葉脈及葉肉細胞，觀察背景顏色深，干擾觀察視野，不利于炭疽菌發育進程和侵染結構的顯微觀察。剛果紅毒性低、價格便宜，作為染色劑常用于篩選產纖維素酶的真菌菌株[27]，未見用于觀察真菌侵染植物過程的研究報道。本研究采用剛果紅染色橡膠樹葉片中的膠孢炭疽菌，發現該染色劑可以使分生孢子、附著胞、侵染釘、菌絲、分生孢子梗、次級分生孢子等結構著色，染色效果好，觀察背景顏色淺。另外，剛果紅染色法適應性強，自然pH，無需獲得熒光蛋白標記菌株，普通光學顯微鏡即可清楚地觀察到炭疽菌的侵染動態[13]，便于大田檢測，對橡膠樹炭疽病的早期檢測有重要意義。

膠孢炭疽菌侵染途徑有2種，一種是通過自然孔口（氣孔、皮孔）或傷口侵入;另一種是必須依賴于病原菌獨特的侵染結構——附著胞的直接侵入[28]。本研究利用剛果紅染色方法成功地觀察到了膠孢炭疽菌在橡膠樹葉片上的第2種侵染途徑，其過程如下：2 h粘附在寄主表面的分生孢子萌發產生芽管，4 h芽管頂端形成膨大的附著胞，附著胞經過一系列的細胞變化，12 h后附著胞逐漸黑化形成侵染釘，侵入葉片組織。炭疽菌與稻瘟菌一樣，附著胞會積累高膨壓的溶質，產生巨大的壓力。Bechinger等[28]測量了C. graminicola附著胞產生的壓力，發現附著胞能形成高達5 Mpa的壓強，迫使侵染釘穿透寄主表面角質層和表皮細胞壁后分化成初生菌絲在表皮細胞內生長。

本研究發現膠孢炭疽菌在橡膠樹上的發育進程與在其他寄主上的發育進程非常相似，但也存在一些差異。膠孢炭疽菌分生孢子在橡膠樹葉片上可萌發產生多個芽管，附著胞形成后還會伴隨次級附著胞的形成，大大提高其侵染率，致使橡膠樹炭疽病在條件適宜的情況下便可在極短時間內暴發成災，但膠孢炭疽菌在侵染番石榴、草莓等寄主的過程中卻很少產生多個芽管及附著胞[29-30]，初步分析其原因可能是橡膠樹葉片表面蠟質層這一疏水結構在短時間內有利于附著胞的形成[31]。另外，橡膠樹膠孢炭疽菌的分生孢子芽管頂端可以形成次級分生孢子，但沒有發現次級分生孢子萌發和產生附著胞的現象。此時次級分生孢子可能處于休眠狀態，于葉片殘體越冬后，在雨水和氣流作用下傳播侵染新葉，成為翌年的初侵染源[32]。

4? 結論

本研究建立了一種著色效果好，簡便易行，經濟有效的橡膠樹葉片中膠孢炭疽菌的染色方法，進一步明確了膠孢炭疽菌的侵染結構，發現該病原菌通過分生孢子萌發形成多個芽管、附著胞、次級附著胞和次級分生孢子等侵染結構來提高其侵染橡膠樹的幾率。本研究結果對橡膠樹炭疽病的組織病理學及流行病理學研究具有重要意義，為該病害的預測預報提供了科學依據。

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責任編輯：謝龍蓮