響應面優化提取向日葵列當中苯乙醇苷的工藝研究

呂佳佳，張 勇，戴余軍*，江 芹，魏帥潤喆，蔡樹龍，殷 曉

(1.湖北工程學院 湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心，湖北 孝感 432000； 2.湖北大學 生命科學學院，湖北 武漢 430062)

向日葵列當(OrobanchecumanaWallr.)俗稱獨根草、兔子拐棍，為列當科(Orobanchaceae)列當屬(Orobanche)一年生全寄生性草本植物，在我國分布很廣，主要分布于河北、北京、新疆、山西、內蒙古、黑龍江、遼寧、吉林等省(自治區、直轄市)[1-2]。列當屬多種植物在我國部分地區民間已作為藥用，其全草可入藥，具有強筋壯骨、壯陽補腎、延緩衰老、改善腦組織循環、增強免疫等功效[3-4]。其主要的活性成分為苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides，PhGs)，是一類由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖基組成的天然化合物，其結構特征主要是以β-葡萄糖為母核的并含有酯鍵及氧苷鍵，羥基和甲氧基連于苯乙基上，中心葡萄糖基上常連有乙酰基和咖啡酰基[5]，其結構式見圖1。現代藥理研究表明，苯乙醇苷類化合物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等方面發揮著重要的作用[6-12]。向日葵列當是一種專化性較強的寄生性雜草，由于其自身沒有葉綠素，不能進行光合作用，得完全靠從寄主向日葵根部吸取營養而存活，從而影響向日葵的產量和品質[13-15]。所以長期以來，向日葵列當一直被當作農田雜草進行防治根除，其藥用價值被長期忽視。

圖1 苯乙醇苷基本結構

本研究以向日葵列當全草為原料，采用乙醇加熱回流法提取向日葵列當中苯乙醇苷，在單因素的試驗結果的基礎上，利用響應面法對其工藝條件進行優化，以期為向日葵列當藥用資源的開發利用奠定基礎。

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

T9CS型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；HH-6型數顯恒溫水浴鍋(常州市億能實驗儀器廠)；GTR16-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司)；PTX-JA2105電子天平(華志電子科技有限公司)；超純水(Milli-Q純水系統，武漢優普純水設備有限公司)。向日葵列當于2020年9月購自內蒙古商都縣；毛蕊花糖苷標準品(CAS No：61276-17-3，批號：M01101910014 ，HPLC > 99%)購自北京中科質檢生物技術有限公司；甲醇(色譜級)和乙醇(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 苯乙醇苷的提取

1.2.1 原料預處理

將一定量向日葵列當洗凈后，置60 ℃干燥箱烘干，于多功能粉碎機中粉碎，過60目篩(0.25 mm孔徑)，密封冷藏備用。

1.2.2 提取工藝流程

向日葵列當粉與一定體積分數的乙醇配制成一定液固比→在一定溫度下加熱回流一定時間→離心(轉速5000 r/min，15 min)→濾渣重復浸提一定次數→合并濾液，得到待測樣品溶液。

1.2.3 最大吸收波長的確定

精密量取適量標準品、樣品溶液，于200 ～ 800 nm處進行全波長掃描。

1.2.4 樣品中苯乙醇苷含量的測定

本研究采用紫外分光光度法測定向日葵列當中苯乙醇苷含量[16]。用乙醇配制毛蕊花糖苷標準液(100 μg/mL)，精確吸取1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 mL標準液并定容至25 mL，充分混勻。以95%乙醇為空白，在335 nm下測定吸光度值，以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。回歸方程為：y=0.0289x+ 0.003(R2=0.9999)，表明在0 ～ 52 μg/mL范圍內毛蕊花糖苷濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

樣品溶液用95%乙醇溶液稀釋至合適濃度，測定335 nm處吸光度值，計算樣品中苯乙醇苷含量。苯乙醇苷得率的計算公式為：

式中：Y為苯乙醇苷得率(%)，C為樣品溶液中苯乙醇苷的含量(μg/mL)，V為樣品溶液體積(mL)，N為稀釋倍數，M為樣品質量(g)。

1.2.5 影響提取效果的因素試驗

1)單因素試驗設計

分別對溶劑的種類(乙醇、甲醇、水)、溶劑質量分數(35%,45%,55%,65%,75%)、提取溫度(35,50,65,80,85 ℃)、提取時間(30,60,90,120,150 min)、液固比(10∶1,20:1,30:1,40:1,

50:1(mL/g))、提取次數(1,2,3,4,5)進行單因素考察。

2)響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，根據響應面法Central Composite Design設計原理，以單因素結果所選因素為自變量，苯乙醇苷得率為響應值，進行4因素3水平響應面試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行多元線性回歸方程擬合，檢驗模型，根據模型進行響應值預測，優化向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝條件，并進行驗證試驗。

1.2.6 數據處理

所有試驗均重復3次，所得數據分別用Excel 2016、Design-Expert 8.0.6軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長的確定

由圖2可知，標準品和樣品均在335 nm處有最大吸收峰，故選擇335 nm作為本試驗苯乙醇苷的測定波長。

圖2 標準品和樣品的掃描光譜圖

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 溶劑的種類對苯乙醇苷提取效果的影響

不同的提取溶劑對苯乙醇苷提取效果的影響見圖3。由圖3可知，3種不同溶劑提取苯乙醇苷得率分別為9.23%(乙醇)、7.70%(甲醇)和4.31%(水)，由于乙醇具有低毒性、高滲透性和易揮發性等性質，其在天然活性成分的提取中備受青睞。因此，本研究選用乙醇作為后續實驗提取劑。

圖3 溶劑種類對苯乙醇苷得率的影響

2.2.2 溶劑質量分數對苯乙醇苷提取效果的影響

不同溶劑質量分數對苯乙醇苷提取效果的影響見圖4。由圖4可知，當溶劑質量分數在35% ～ 55%時，苯乙醇苷得率隨溶劑質量分數的增大而增加，當溶劑質量分數大于55%，隨著溶劑質量分數的增大，苯乙醇苷得率反而下降，這可能是較高的溶劑質量分數使苯乙醇苷的溶出率趨于飽和，同時使其他醇溶性物質增多，從而導致苯乙醇苷得率下降。因此選擇最佳的溶劑質量分數為55%。

圖4 溶劑質量分數對苯乙醇苷得率的影響

2.2.3 提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響

溫度的高低，會影響苯乙醇苷分子之間的擴散速度。不同提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響見圖5。由圖5可知，隨著提取溫度的升高，苯乙醇苷提取得率呈現先升高后降低的趨勢，在30 ～ 80 ℃時，隨提取溫度的增加而升高，當提取溫度超過80 ℃后，苯乙醇苷提取得率呈下降趨勢，這可能是由于過高的提取溫度影響了苯乙醇苷的穩定性，因此選擇最佳的提取溫度為80 ℃。

2.2.4 提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響

時間因素是影響工業化產量周期的一個關鍵性因素，因此常作為工業提取重要的因素考察。不同提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響見圖6。由圖6可知，隨著提取時間的延長，苯乙醇苷提取得率呈現先升高后急劇下降至基本穩定的趨勢。在60 min時，苯乙醇苷得率最高，這可能是因為在60 min前，原料中的物質在提取溶劑中得到充分溶解。繼續延長浸提時間，開始急劇下降最后趨于穩定，這可能是由浸提時間過長導致苯乙醇苷物質的活性發生改變，且較長的時間也會大大影響工業化生產周期。因此選擇最佳的提取時間為60 min。

圖5 提取溫度對苯乙醇苷得率的影響

圖6 提取時間對苯乙醇苷得率的影響

2.2.5 液固比對苯乙醇苷提取效果的影響

合適的液固比可以減少原料和試劑的消耗。不同液固比對苯乙醇苷提取效果的影響見圖7。由圖7可知，隨著液固比的增加，苯乙醇苷提取得率隨之增大，當液固比為40:1(mL/g)之后，苯乙醇苷得率開始下降，這可能是在苯乙醇苷提取的過程中，需要一定的溶劑滲入原料的孔隙中，進行溶解出苯乙醇苷，當溶劑過多時，溶解出的苯乙醇苷達到飽和后便開始稀釋苯乙醇苷溶液，進而導致苯乙醇苷得率降低。因此選擇最佳的液固比為40:1(mL/g)。

圖7 液固比對苯乙醇苷得率的影響

2.2.6 提取次數對苯乙醇苷提取效果的影響

選擇合適的提取次數，既可以最大限度獲取苯乙醇苷，也可以在一定程度上節省時間，減少提取劑的浪費。不同提取次數對苯乙醇苷提取效果的影響見圖8。由圖8可知，隨著提取次數的增加，苯乙醇苷提取得率隨之增加，提取4次后，苯乙醇苷得率漸漸趨于穩定，說明在提取4次后，苯乙醇苷類物質已基本提出。因此，綜合考慮，在優化試驗中，將提取次數固定為4次。

2.3 響應面法優化向日葵列當中苯乙醇苷提取工藝

2.3.1 Design-Expert 8.0.6設計及試驗結果

在單因素試驗結果的基礎上，提取次數固定為4次，采用響應面(Central Composite Design)設計原理。以苯乙醇苷得率為響應值(Y)，選取溶劑質量分數(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、液固比(D)作為自變量，建立4因素3水平共30個試驗點的響應面分析試驗模型，其中24個為析因點，6個為檢驗誤差的中心點。因素水平表見表1，試驗設計和結果見表 2。

圖8 提取次數對苯乙醇苷得率的影響

表1 響應面試驗因素水平表

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.2 響應面方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行方差分析，結果見表3。由表3可知，模型顯著性檢驗為極顯著(P< 0.01)，說明模型的建立具有統計學意義。失擬項為不顯著(P= 0.3259 > 0.05)，說明模型與實驗的誤差較小，無擬合因子的缺失。F值的大小可直接判斷各因素對苯乙醇苷得率的影響程度，F值越大，對苯乙醇苷得率的影響就越顯著。F值大小依次為：提取溫度 > 提取時間 > 溶劑質量分數 > 液固比。校正決定系數R2=0.9951，說明自變量引起的苯乙醇苷得率變化占99.51%，變異系數為0.15%，說明模型中只有0.15%的變異，進一步印證該模型具有較好的擬合度。

通過模型分析，以苯乙醇苷得率(Y)對A、B、C、D的二次多項式回歸方程為：

Y=6.06+0.3A+0.68B+0.18C+0.063D+0.044AB+0.052AC+0.075AD+0.55BC-0.41BD-0.2CD+0.11A2+0.25B2-0.051C2+0.25D2+0.15ABC+0.36BCD-0.41A2B-1.06A2D-0.079AB2+0.85A2B2(R2=0.9951)。

模型中，A、B、C、BC、BD、CD、B2、D2、ABC、BCD、A2B、A2D、A2B2對苯乙醇苷得率的影響為極顯著(P< 0.01)。

表3 響應面方差分析表

2.3.3 響應曲面分析

響應曲面可直觀反映各因素之間交互的顯著性，響應曲面越陡峭，說明因素之間的交互作用越顯著，影響越大，反之則影響越小[17]。利用 Design-Expert 8.0.6 軟件可以分析各因素對苯乙醇苷得率的影響以及任意2個因素之間的交互作用，響應面曲線見圖9。由圖9可知，在交互項對苯乙醇苷得率的影響中，當其他因素保持在零水平時，溶劑質量分數的改變對提取溫度、提取時間和液固比的顯著影響程度不大，反之也是。這說明溶劑質量分數與提取溫度、提取時間和液固比之間的交互作用并不顯著，但其他因素之間的交互作用顯著，這與表3方差分析結果是一致的。

圖9 各因素交互作用對苯乙醇苷得率影響的響應面圖

2.4 最佳工藝條件的確定及模型驗證

為了確定最佳工藝優化參數，利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型方程進行進一步分析，得到向日葵列當中苯乙醇苷提取的最佳工藝參數為：溶劑質量分數為55%，提取溫度為85 ℃，提取時間為90 min，液固比為30:1(mL/g)，提取次數為4次。在此條件下，模型預測苯乙醇苷得率為10.117%，與試驗15號條件一致。為進一步確定其工藝參數的可行性及穩定性，在上述條件下進行驗證性試驗，平行測定3次，苯乙醇苷平均得率為10.223%±0.03%，與模型預測值相比，相對誤差約為0.106%，這說明實際值與模型預測值之間無顯著性差異。由此可知，通過此模型來預測向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝是可行的。

3 小結

本研究采用干燥的向日葵列當粉末為原料，乙醇為提取溶劑進行回流提取。通過單因素試驗及響應面優化試驗確定了向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝：溶劑質量分數為55%，提取溫度為85 ℃，提取時間為90 min，液固比為30:1(mL/g)，提取次數為4次，在此條件下，苯乙醇苷得率為10.223%±0.03%，與模型預測值相比無顯著性差異。通過響應面模型分析，該工藝條件是穩定可行的。