類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

孫廣瀚許 霞萬 磊王玉鳳南淑玲趙 黎劉 瑩

安徽中醫(yī)藥大學(xué)，合肥230012

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，表現(xiàn)為持續(xù)的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等，反復(fù)滑膜炎、血管翳形成會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形［1］。全球患病率約為1%［2］，男女發(fā)病率不同，約為1 ∶3［3］。對(duì)于研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，動(dòng)物模型被廣泛用于探索其發(fā)病機(jī)制和治療方法的研究。目前已經(jīng)建立多種動(dòng)物模型用于研究RA 的發(fā)病機(jī)制，以及藥物對(duì)其治療作用，發(fā)現(xiàn)作用靶點(diǎn)，其中大致包括誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的關(guān)節(jié)炎模型。為進(jìn)一步闡明中醫(yī)藥的作用，構(gòu)建出病證結(jié)合動(dòng)物模型，這些模型各有優(yōu)缺點(diǎn)。遂將上述誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型，基因工程型動(dòng)物模型，及病證結(jié)合動(dòng)物模型進(jìn)行介紹，以便風(fēng)濕病科研人員在今后的研究中選擇合適的動(dòng)物模型，為治療RA 頑疾而進(jìn)一步開展研究。

1 誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型

1.1 弗氏佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

1956 年Freund［4］報(bào)道給予佐劑進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)炎，骨關(guān)節(jié)炎和骨膜炎的動(dòng)物造模方法。其原理是利用結(jié)核分枝桿菌上的蛋白分子與關(guān)節(jié)滑膜上的相似，可以被同一株T 細(xì)胞所識(shí)別，從而誘發(fā)抗原抗體反應(yīng)，引發(fā)炎癥。在弗氏佐劑注射的大鼠中，促甲狀腺激素水平的24 h 無明顯變化，而催乳素和促腎上腺皮質(zhì)激素的24 h 持續(xù)存在變化，說明弗氏佐劑注射后早期免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)促腎上腺皮質(zhì)激素、生長激素、催乳素和促甲狀腺激素釋放的顯著影響［5］。并有研究［6］表明，使用弗氏佐劑結(jié)合低密度脂蛋白衍生的抗原對(duì)載脂蛋白E 缺陷小鼠進(jìn)行免疫，可降低動(dòng)脈粥樣硬化病變的進(jìn)展。使用弗氏佐劑單次皮下注射可誘導(dǎo)大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎，而且還可以引發(fā)超出關(guān)節(jié)組織的其他全身反應(yīng)［7］。并且多次注射發(fā)病率高于單次注射，發(fā)病快，在很短的時(shí)間內(nèi)就可觀察到病變。Nazirah Bashir 等［8］在尾巴根部一次皮內(nèi)注射0.1 mL 弗氏完全佐劑，導(dǎo)致NF?κB、TGF?β、TNF?α、IL?1β、IL?6 和Hs?CRP 水平的增加和IL?10 水平的降低。

1.2 膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型

Trentham 等［9］報(bào)道了通過用同種或異種II 型膠原（Collagen type II，CII）完全或不完全弗氏佐劑進(jìn)行皮內(nèi)免疫在大鼠中誘發(fā)多關(guān)節(jié)炎。為了開發(fā)更適合RA 研究的自身免疫實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，向DBA／1 品系小鼠注射100 mg 純化的天然異源CII，并表明向小鼠注射同源CII 引起的多關(guān)節(jié)炎比異源CII 引起的疾病在臨床上更接近人類RA［10］。CII 是人軟骨基質(zhì)的主要成分，一般CIA 型動(dòng)物模型用II 型膠原乳劑兩次給藥，分別行初次免疫與加強(qiáng)免疫，初次免疫在大鼠的尾根部和背部注射，在尾根部和背部皮內(nèi)注射［11］，也有在腹側(cè)和尾側(cè)靜脈之間的空間進(jìn)行注射［12］。Chen 等［13］用等體積的不完全弗氏佐劑乳化了免疫級(jí)II 型牛II 型膠原蛋白，第一天將0.2 mL乳化液皮下注射到治療組大鼠的尾巴基部，然后在一周后進(jìn)行加強(qiáng)注射。除對(duì)動(dòng)物的一般狀態(tài)、體重變化、關(guān)節(jié)局部、足爪腫脹度、關(guān)節(jié)炎評(píng)分外，還進(jìn)行病理學(xué)及血管內(nèi)皮生長因子免疫組織化學(xué)法檢測、滑膜微血管檢測、細(xì)胞因子的檢測［14?15］。

2 基因工程型關(guān)節(jié)炎模型

TNF?α 參與RA 的發(fā)病機(jī)制最初是由幾種體外方法提出的，這些方法表明TNF?α 可以刺激人滑膜細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中的膠原酶和許多其他基質(zhì)金屬蛋白酶和重組TNF?α。TNF?α 可能在細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于上游低位，有實(shí)驗(yàn)［16］表明，阻斷TNF?α的生物活性會(huì)抑制滑膜細(xì)胞中IL?1 的產(chǎn)生并中和IL?1 的生物活性，還抑制了其他幾種促炎或免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，包括粒細(xì)胞?巨噬細(xì)胞集落刺激因子，IL?6 和IL?8。TNF 轉(zhuǎn)基因小鼠（TNF?Tg 系3647）最初是從Dr.G.Kollias 獲得的，并與C57BL／6 小鼠回交了超過10 代。該系列的TNF?Tg 小鼠攜帶一種人TNF 轉(zhuǎn)基因，并且相對(duì)緩慢地發(fā)展為慢性關(guān)節(jié)炎。TNF?Tg 小鼠1 mon 大時(shí)，踝關(guān)節(jié)健康。當(dāng)2.5 mon 大時(shí)，出現(xiàn)輕度的踝關(guān)節(jié)發(fā)炎和骨侵蝕，5 mon 后會(huì)變得更加嚴(yán)重［17］。如朱興旺等［18］即應(yīng)用了人血清TNF?α 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，以觀察中藥復(fù)方對(duì)軟骨侵蝕、骨質(zhì)破壞的療效。

由于K／BxN 血清轉(zhuǎn)移模型依賴于富含自身抗體的血清向受體小鼠的被動(dòng)轉(zhuǎn)移，因此它觸發(fā)了自身免疫性關(guān)節(jié)炎，其多關(guān)節(jié)炎癥多類似RA，并在多種易感小鼠品系中具有近100%的滲透率。轉(zhuǎn)基因K／BxN 小鼠的富含自身抗體的血清轉(zhuǎn)移到幼稚的受體中而引起的，這種模型引發(fā)了劇烈的多關(guān)節(jié)炎。Bálint Botz 等［19］即應(yīng)用了轉(zhuǎn)基因K／BxN 小鼠研究，評(píng)估辣椒素敏感性傳入分子在K／BxN 血清轉(zhuǎn)移性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中的作用。

其他還有用BAHR／c 小鼠中的促甲狀腺素受體抗體進(jìn)行的質(zhì)粒18 或腺病毒誘導(dǎo)的19 免疫是最成功建立的模型，其表現(xiàn)出炎癥改變和眼眶脂肪和肌肉體積增加［20］。也有將人HLADRα+4β 基因轉(zhuǎn)入C57BL／6×DBA／1F 1 代小鼠復(fù)制出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物后，在鼠體內(nèi)注射膠原和佐劑免疫建立RA 模型［21］。

3 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合動(dòng)物模型

3.1 風(fēng)寒濕證

《素問·痹論》論述痹證病因?yàn)椤帮L(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也?！毙陆貐^(qū)RA 主要證型以風(fēng)濕痹阻證為主［22］。且中醫(yī)風(fēng)寒濕證痹病不一定全是表現(xiàn)舌淡苔白脈緊，關(guān)節(jié)冷痛，四肢畏寒等癥，也可夾雜熱象［23］，故原針對(duì)RA 疾病造模所帶來的炎性反應(yīng)并不違背中醫(yī)證候特點(diǎn)。許霞［24］等在建立佐劑性關(guān)節(jié)炎模型后，將大鼠放在2 cm 水深和5～7 ℃冷水條件中，站立20 min，并用風(fēng)扇伴3～4 級(jí)風(fēng)力，每天1 次，持續(xù)14 d，復(fù)制痹病中的風(fēng)寒濕證，結(jié)果可見風(fēng)寒濕證大鼠T 淋巴細(xì)胞中cAMP 含量、CD4+／CD8+T 細(xì)胞比值顯著升高?；蚶弥悄苋斯夂蛳溥M(jìn)行水溫、風(fēng)速等干預(yù)，結(jié)果大鼠足趾明顯腫脹［25］。

3.2 風(fēng)濕熱證

金代張從正［26］”在《儒門事親·指風(fēng)痹痿厥近世差玄說》中提出“痹病以濕熱為源，風(fēng)寒濕為兼”。調(diào)查研究［27］發(fā)現(xiàn)，全國18 個(gè)中心的1388 例RA 患者中以濕熱痹阻證疾病活動(dòng)度最高，安徽地區(qū)RA中醫(yī)證候也是以濕熱痹阻為主［28］。全國18 家研究中心中女性RA 患者主要中醫(yī)證候是濕熱痹阻證［29］，說明濕熱是現(xiàn)代臨床中較為常見的中醫(yī)證型。強(qiáng)宇靖［30］等將大鼠每天置于造模箱中接受風(fēng)、濕、熱刺激（溫度35～37 ℃，濕度80%～99%，風(fēng)速4 m／s，每次30 min），連續(xù)28 d。馬騰茂［31］等除上述文獻(xiàn)中進(jìn)行溫度、濕度、風(fēng)速的刺激外，實(shí)驗(yàn)中還將大鼠足跖沒入37 ℃熱水中，大鼠全身以37 ℃蒸汽熏蒸，10 min 換氣1 次。每天1 次，每次30 min，連續(xù)18 d。病理結(jié)果可見風(fēng)濕熱痹RA 大鼠踝關(guān)節(jié)大面積破壞，大量肉芽組織增生，大量炎性細(xì)胞浸潤，肉芽組織血管豐富，血管擴(kuò)張。

3.3 血瘀證

元代朱丹溪［32］在《丹溪心法·痛風(fēng)論》中提出“惡血入經(jīng)絡(luò)證，血受濕熱，久必凝濁，所下未盡，留滯隧道，所以作痛”，認(rèn)為“瘀血流注”是其發(fā)生的主要病因。清代張璐［33］在《張氏醫(yī)通·痿痹門》中言：“營衛(wèi)滯而不行則麻木……木則全屬濕痰死血”。李茜［34］等以皮下注射0.1 mg／kg 鹽酸腎上腺素注射液及在冷水中游泳。但這種血瘀證更類似于寒凝血瘀。在其他疾病腎虛證的動(dòng)物模型中還采取了其他造模方法，例如進(jìn)行放血造模，結(jié)果可見腸系膜微淋巴管口徑變細(xì)，自主收縮頻率、總收縮活性指數(shù)、淋巴管動(dòng)力學(xué)指數(shù)降低［35］。

3.4 腎虛證

清代喻嘉言［36］在《醫(yī)門法律·中風(fēng)門》更明確指出：“蓋小兒非必為風(fēng)寒濕所痹，多因先天所稟，腎氣衰薄，隨寒凝聚于腰膝而不解?！闭f明了腎虛是痹病重要的病因之一。王燕［37］等在膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠的基礎(chǔ)上應(yīng)用去勢法（摘除雙側(cè)卵巢與睪丸）和羥基脲法（羥基脲375 mg／（kg·d-1）灌胃）制作腎虛證RA 大鼠模型，與CIA 大鼠相比，結(jié)合去勢法、羥基脲法制作的腎虛CIA 大鼠關(guān)節(jié)紅腫程度和關(guān)節(jié)損傷程度明顯加重，并且出現(xiàn)精神萎靡、弓背蜷縮、體毛枯疏、自主活動(dòng)少，反應(yīng)逐漸遲鈍，喜扎堆，飲食減少，大便質(zhì)稀，肛周污穢等癥狀。腎上腺環(huán)腺苷酸與環(huán)鳥苷酸比值明顯降低，IL?6、IL?10 及IFN?γ 水平明顯升高，其中雄性大鼠皮質(zhì)酮含量升高，雌性大鼠的皮質(zhì)酮水平下降，抗Ⅱ型膠原抗體含量明顯升高。在其他疾病腎虛證的動(dòng)物模型中還采取了其他造模方法，例如灌胃給予150 mg·kg-1的腺嘌 呤［38］，或給予15 mg／（kg·d-1）氫化可的松［39］，或針對(duì)雄性大鼠以1 mL（1.5 mg）的甲睪酮及0.2 mL 豬油進(jìn)行灌胃［40］。

3.5 脾虛證

宋代嚴(yán)用和［41］在《濟(jì)生方·痹》提出痹病“皆因體虛，腠理空疏，受風(fēng)寒濕氣而成痹也?！倍w虛中脾虛占重要地位，脾為營衛(wèi)之氣化生之源，清代林珮琴［42］在《類證治裁·痹證》更加明確地指出“諸痹……良由營衛(wèi)先虛，腠理不密，風(fēng)寒濕乘虛內(nèi)襲，正氣為邪氣所阻，不能宣行，因而留滯，氣血凝澀，久而成痹?！闭f明脾虛導(dǎo)致營衛(wèi)不足，腠理不密，外邪內(nèi)侵而致痹。在臨床上從脾虛論治RA 可取得較好的療效［43］。趙宏艷［44］等給予0.5 mg／（kg·d-1）的利血平腹腔注射制作脾虛證RA 大鼠模型。在其他疾病脾虛證的動(dòng)物模型中還采取了其他造模方法，例如用灌胃60 g／（kg·d-1）的小承氣湯并限制大鼠自主活動(dòng)［45］，游泳致勞聯(lián)合特制飼料喂養(yǎng)［46］，200%、劑量20 g／kg 的大黃進(jìn)行灌胃配合隔天游泳及隔天禁食的方法［47］。

4 結(jié)語

近年來，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐漸上升，人們對(duì)其研究逐漸增多［48］。科研人員通過構(gòu)建RA 動(dòng)物模型來研究RA 的發(fā)生發(fā)展，并結(jié)合藥物對(duì)其進(jìn)一步研究。構(gòu)建方法也從誘導(dǎo)型發(fā)展至基因工程等。但是，在使用基因工程技術(shù)為特定基因產(chǎn)生突變生物時(shí)，我們應(yīng)仔細(xì)考慮可能產(chǎn)生的表型中存在發(fā)揮潛在作用的靶點(diǎn)。

辨證論治是中醫(yī)治療疾病的特色，《類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎病證結(jié)合診療指南》中證型即有風(fēng)濕痹阻證、寒濕痹阻證、濕熱痹阻證、痰瘀痹阻證、瘀血阻絡(luò)證、氣血兩虛證、肝腎不足證、氣陰兩虛證等［49］，在疾病發(fā)生中最主要的即濕熱痹阻證與寒濕痹阻證，但兩者在人口學(xué)特征上差異不明顯，而臨床指標(biāo)方面，ESR、CRP、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)與疾病活動(dòng)度上有顯著差異。采用大鼠復(fù)制RA 疾病再施加風(fēng)、寒、濕、熱等外因建立此模型，這種模型已經(jīng)得到肯定，既滿足中醫(yī)證候特征，又符合RA 的病理特點(diǎn)，同時(shí)可以更好地闡明中醫(yī)藥的作用機(jī)制。但是這些造模方法只是單純地將西醫(yī)的“病”與中醫(yī)的“證”相疊加，但是在檢驗(yàn)造模是否成功時(shí)，沒有收集中醫(yī)證候四診信息。而且現(xiàn)階段中醫(yī)證型造模單一，不能完全反映出具有中醫(yī)特色的模型。另外對(duì)于痰瘀痹阻證、氣陰兩虛證大鼠模型缺乏研究文獻(xiàn)，未來應(yīng)該考慮對(duì)虛實(shí)夾雜等復(fù)雜病機(jī)的大鼠模型總結(jié)和研發(fā)。所以特別是在病證結(jié)合動(dòng)物模型研究出一種與中醫(yī)證候更貼近，方便進(jìn)行后續(xù)藥效或機(jī)制等的研究，操作更為便捷、經(jīng)濟(jì)，更加全面反應(yīng)中醫(yī)痹病特色的動(dòng)物模型是今后研究RA 病證結(jié)合動(dòng)物模型的重要內(nèi)容之一。