超高壓對西瓜汁香氣相關(guān)酶的活性影響研究

包洪亮 ，馬永杰，王瑞杰，胡慧杰，杜詠芳，胡雪靜，高雪楠

（1.洛陽師范學(xué)院數(shù)學(xué)科學(xué)學(xué)院，河南洛陽 471934；2.洛陽師范學(xué)院食品與藥品學(xué)院，河南洛陽 471934）

西瓜汁是很有潛力的果汁飲品，具有生津止咳、清熱解暑、減輕浮腫、利尿等作用，深受人們的喜愛。但西瓜汁屬于熱敏性物料，在加工過程中容易出現(xiàn)不良?xì)馕丁⒖诟邢陆怠I養(yǎng)損失等問題，從而影響產(chǎn)品質(zhì)量。大量試驗(yàn)研究表明，果蔬香氣物質(zhì)由果蔬中各種關(guān)鍵酶作用于亞麻酸、亞油酸等香氣前體物質(zhì)而生成，尤其是果蔬汁在貯藏過程中，其風(fēng)味的變化主要是由果蔬汁中的脂氧合酶、過氧化物酶及醇酰基轉(zhuǎn)移酶等引起的[1-3]。作為非熱加工技術(shù)，超高壓處理在保證食品安全性的基礎(chǔ)上，可使酶被激活或者鈍化，不破壞食物的原始風(fēng)味與營養(yǎng)物質(zhì)，能在低溫或室溫條件下達(dá)到商業(yè)無菌，最大程度地保留食品原有的色、香、味，對保持食物品質(zhì)起到很好的作用[4]。此外，超高壓還具有施壓過程均勻、滅菌均勻、安全系數(shù)高、耗能相對較少等優(yōu)點(diǎn)[5]，適用于富含芳香物質(zhì)的熱敏性果蔬的加工與處理，并且原料的香味揮發(fā)及營養(yǎng)物質(zhì)損失較少。目前，超高壓技術(shù)在草莓、蘋果、柿子、獼猴桃、芒果、杏汁及橙汁等食品加工方面都有一定的應(yīng)用研究[5-8]，而在西瓜汁方面的研究較少。

研究表明，脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、氫過氧化物裂解酶（hydroperoxide lyase，HPL）和醇酰基轉(zhuǎn)移酶（acyltransferase，AAT），普遍存在于高等植物中，在植物脂肪酸代謝過程中發(fā)揮著較大作用[9-12]。這些酶在西瓜冷藏過程中，如果被激活，會(huì)使一些風(fēng)味物質(zhì)如己醛、反-2-壬烯醛、順-2-壬烯醇、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮等的質(zhì)量濃度降低，從而降低西瓜香氣品質(zhì)[3]。因此，要采取相應(yīng)技術(shù)來控制這三種酶的活性，保留西瓜汁貯藏期內(nèi)的香氣成分。本文從改變西瓜汁的殺菌技術(shù)、避免高溫處理過程入手，結(jié)合處理溫度、時(shí)間、壓力參數(shù)，旨在探求適宜的西瓜汁加工工藝，解決傳統(tǒng)熱處理帶來的問題，使西瓜汁各指標(biāo)達(dá)到市場標(biāo)準(zhǔn)并延長產(chǎn)品貨架期，降低加工難度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

超高壓設(shè)備，BDS200FL，英國STANSTED 公司；紫外分光光度儀，UV-1800，日本島津有限公司；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜，GC-MS-QP2010，日本島津有限公司；離心機(jī)，Sigma-18K，Sartorius 儀器有限公司；單道移液槍，VP，德國Eppendorf 艾本德股份公司；手持式打漿機(jī)，HD2069/01，飛利浦電子有限公司。

冰醋酸、無水醋酸鈉、十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、鹽酸、硼酸、亞油酸（LA）、吐溫20、氫氧化鈉、ADH（醇脫氫酶）、Acetyl-CoA（乙酰輔酶A），均購于上海博湖生物有限公司；Tris 堿、MES-TRIS 緩沖液、40%乙醛、Triton-X100（聚乙二醇辛基苯基醚）、PVPP（交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮）、氯化鎂、丁醇、DTNB（二硝基苯甲酸），以上所用試劑全部為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水；順-2-壬烯醇、壬醛、正己醛、反-2-壬烯醛、反,順-2,6-壬二烯醇、鄰苯二甲酸二乙酯、6,10-二甲基-5,9-十一雙烯-2-酮、2-戊基呋喃、十一酸甲酯，分析純，美國Sigma 公司；色譜級乙醇，含量95%，天津市彪仕奇有限公司。

選取新鮮成熟、無機(jī)械損傷的‘鄭抗無籽1 號’無籽西瓜作為實(shí)驗(yàn)材料，購于洛陽盛德美超市。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 西瓜汁的制備

選取新鮮成熟、品質(zhì)優(yōu)良、無病蟲害、無機(jī)械損傷的無籽西瓜，取中心部分瓜瓤榨汁。西瓜汁用單層濾布過濾，然后將過濾后的西瓜汁分裝于鋁箔紙制成的包裝袋中，每袋裝20～30 mL，用塑料薄膜封口機(jī)封口。

1.2.2 超高壓處理及貯藏期試驗(yàn)

將密封好的西瓜汁置于超高壓壓力釜中，調(diào)整壓力釜內(nèi)水至合適的高度，溫度為45 ℃，設(shè)定壓力開始施壓即可。

通過查閱文獻(xiàn)[3]，根據(jù)消費(fèi)習(xí)慣，對于鮮榨果汁，通常在7 d 之內(nèi)被消費(fèi)完，而通過600 MPa、60 min 超高壓處理西瓜汁，其保質(zhì)期遠(yuǎn)超過7 d。因此，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)，從節(jié)約能源和提高效率方面考慮，試驗(yàn)處理?xiàng)l件設(shè)定為200 MPa、20 min，400 MPa、10 min，400 MPa、20 min，400 MPa、30 min，600 MPa、20 min，對照組為用鋁箔紙密封包裝后未經(jīng)高壓處理的西瓜汁。將處理后的樣品和對照組置于4 ℃冰箱內(nèi)，貯藏0、1、2、3、5、10 d，隨機(jī)抽取樣品進(jìn)行酶活及風(fēng)味物質(zhì)的測定。以原汁為對照，研究處理壓力、處理時(shí)間及貯藏期對西瓜汁中LOX、HPL 及AAT 活性的影響。

1.3 酶活性的測定方法

1.3.1 LOX 活性測定

樣品制備：取1.5 mL 西瓜汁和8 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預(yù)冷的離心機(jī)內(nèi)，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心15 min，所得上清液即為粗酶液。

反應(yīng)體系：采用3 mL 反應(yīng)體系。取2.8 mL 磷酸緩沖液（pH=6.8）和100 μL、0.1 mol/L 反應(yīng)底物液（亞油酸鈉）于具塞試管中，混合搖勻后放入30 ℃水浴鍋中保溫10 min，之后再加入粗酶液100 μL；混勻后倒入比色皿內(nèi)，反應(yīng)開始15 s 時(shí)，在室溫25 ℃下，波長234 nm 處測定吸光值，記錄15 s 后的1 min 內(nèi)吸光度OD 值的變化。

1.3.2 HPL 活性的測定

樣品制備：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預(yù)冷的離心機(jī)內(nèi)，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心30 min，所得上清液即為粗酶液。

反應(yīng)體系：采用3.5 mL 反應(yīng)體系。取2 mL 醋酸緩沖液、0.75 mL 反應(yīng)底物液、0.15 mL NADH、0.1 mL ADH 酶液和0.5 mL 粗酶液于具塞試管中，混合搖勻后倒入比色皿內(nèi)，在室溫下于波長340 nm 處測定吸光值，記錄1 min內(nèi)OD 值的變化。

1.3.3 AAT 活性的測定

樣品制備：取2 mL 西瓜汁和5 mL 磷酸緩沖液（pH=7.0）于離心管中，將離心管放入已預(yù)冷的離心機(jī)內(nèi)，在4 ℃條件下，15 000 r/min 離心30 min，所得上清液即為粗酶液。

反應(yīng)體系：采用3 mL 反應(yīng)體系。取2.5 mL MgCl2溶液、150 μL、乙酰-CoA（乙酰輔酶A）、50 μL 丁醇和150 μL 粗酶液于具塞試管中混合搖勻，添加100 μL 的DTNB，搖勻后倒入比色皿內(nèi)，在室溫下于波長412 nm 處測定吸光值，記錄1 min 內(nèi)OD 值的變化。

1.3.4 西瓜汁中典型風(fēng)味物質(zhì)含量的方法測定

采用氣相色譜內(nèi)標(biāo)法，測定西瓜汁中的風(fēng)味物質(zhì)，內(nèi)標(biāo)物溶液的配制及風(fēng)味物質(zhì)的測定方法參照劉野等[3]的方法，稍有改動(dòng)。每個(gè)樣品取8 mL 西瓜汁，加入到體積為15 mL 的萃取瓶中。加入0.01%（體積分?jǐn)?shù)）內(nèi)標(biāo)物溶液0.05mL，使內(nèi)標(biāo)物在西瓜汁樣品的質(zhì)量濃度為0.546mg/mL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

三種酶殘存活性的測定均進(jìn)行3 次平行操作，取平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采取Excel 2010 軟件統(tǒng)計(jì)，以O(shè)rigin 9.0繪圖。風(fēng)味物質(zhì)測定數(shù)據(jù)處理，采用SAS 8.12 及Ducan’s多重檢驗(yàn)（P＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜汁中LOX 活性的變化

超高壓處理可使酶激活或鈍化，影響香氣合成途徑中酶的作用，進(jìn)而影響前體物質(zhì)向香氣化合物的轉(zhuǎn)化[13-14]。一般情況下，采用較低壓力時(shí)，如300 MPa 對PPO、POD 及LOX 等有激活作用，水果中某些香氣成分會(huì)因這些酶的激活而受到損失，而400 MPa 處理時(shí)可使部分酶失活，使香氣物質(zhì)的降解減少[1]。經(jīng)相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中LOX 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖1 所示。相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中LOX在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖2 所示。

圖1 相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間LOX 活性的變化Fig.1 Changes of LOX activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different holding time during storage at 4 ℃

圖2 相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間LOX 活性的變化Fig.2 Changes of LOX activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖1、2 可見，貯藏期為0 d 時(shí)，經(jīng)超高壓處理后的LOX 活性均低于對照組。由圖1 可知，相同壓力下，保壓時(shí)間越久，酶活性越低；在相同保壓時(shí)間下，壓力越大，對LOX 活性的鈍化作用越強(qiáng)。隨著貯藏天數(shù)的增加，對照組西瓜的LOX 活性有降低趨勢，而經(jīng)超高壓處理后的LOX 活性則隨貯藏天數(shù)的增加先上升后降低，基本在1～2 d 達(dá)到最大值。貯藏期為10 d 時(shí)，相同壓力不同保壓時(shí)間下，LOX 活性基本一致。另外，貯藏期為2 d 時(shí)，400 MPa、10 min 條件下的LOX 活性急速降低，可能是由試驗(yàn)中的誤差所致。

由圖2 可知，400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 這兩組處理，LOX 活性均是在1～2 d 內(nèi)顯著上升，而在貯藏2 d 后，酶的活性均呈下降趨勢，隨后隨貯藏天數(shù)的增加呈降低趨勢。而在200 MPa、20 min 時(shí)，LOX 活性的趨勢和對照組基本一致，說明200 MPa、20 min 的處理?xiàng)l件對LOX 活性基本無影響。

2.2 西瓜汁中HPL 活性的變化

經(jīng)相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中HPL 酶在4 ℃貯藏條件下，酶活性的變化如圖3 所示。相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中HPL 在4 ℃貯藏條件下，酶活性的變化如圖4 所示。

圖3 相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間HPL 活性的變化Fig.3 Changes of HPL activity in watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa) at different pressurekeeping time at 4 ℃during storage

圖4 相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間HPL 活性的變化Fig.4 Changes of HPL activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖3、4 可知，貯藏第0 天時(shí)，經(jīng)超高壓處理后的HPL 活性均高于對照組。隨著貯藏天數(shù)的增加，對照組西瓜汁的HPL 活性在0～2 d 時(shí)略微上升，隨后呈降低趨勢，而經(jīng)超高壓處理后的HPL 活性則隨貯藏天數(shù)的增加逐漸上升，在1～2 d HPL 活性達(dá)到最大值，2 d 后，酶活性也隨著貯藏天數(shù)的增加而逐漸降低。貯藏期為10 d時(shí)，相同的壓力不同的保壓時(shí)間下，保壓時(shí)間越長酶活性越低。此外，貯藏期在1～2 d 時(shí)，200 MPa、20 min 處理的HPL 活性急速上升，且在2～3 d 內(nèi)仍維持最大值，該值遠(yuǎn)超過其他組，這說明在200 MPa、20 min 處理?xiàng)l件下貯藏時(shí)間1～3 d 對HPL 有較強(qiáng)的激活作用。

2.3 西瓜汁中AAT 活性的變化

經(jīng)相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間（10、20、30 min）處理的西瓜汁中AAT 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖5 所示。

圖5 相同壓力（400 MPa）不同保壓時(shí)間處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間AAT 活性的變化Fig.5 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with the same pressure (400 MPa)at 4 ℃for different holding time

相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力（200、400、600 MPa）處理的西瓜汁中AAT 在4 ℃貯藏條件下，其酶活性的變化如圖6 所示。

圖6 相同保壓時(shí)間（20 min）不同壓力處理的西瓜汁在4 ℃貯藏期間AAT 活性的變化Fig.6 Changes of AAT activity during storage of watermelon juice treated with different pressure at 4 ℃for the same holding time (20 min)

由圖5 和圖6 可知，貯藏期為0 d 時(shí)，超高壓處理后的AAT 活性均低于對照組，隨著貯藏天數(shù)的增加，對照組和超高壓處理的AAT 活性均逐漸上升，且在1～2 d達(dá)到最大值，2 d 之后，AAT 活性隨著貯藏天數(shù)的增加呈遞減趨勢，10 d 以后AAT 基本無活性。

400 MPa、10 min 和200 MPa、20 min 兩組的酶活性在1 d 時(shí)達(dá)到最大值，而400 MPa、20 min 和600 MPa、20 min 這兩組的AAT 活性均是在2 d 時(shí)達(dá)到最大值，之后隨貯藏天數(shù)的增加呈降低趨勢，而400 MPa、30 min AAT活性的變化趨勢和對照組基本一致，說明400 MPa、30 min 的處理?xiàng)l件對AAT 活性影響不明顯，除此之外，貯藏2～3 d 時(shí)，200 MPa、20 min AAT 活性急速降低且低于對照組，可能是由誤差所致。

通過以上分析可知，超高壓處理西瓜汁的最佳參數(shù)條件是壓力400 MPa，保壓時(shí)間20 min，貯藏期1～10 d。在最佳參數(shù)條件下，三種酶的活性有一定程度的鈍化，可以有效保證西瓜汁的風(fēng)味品質(zhì)。

2.4 超高壓處理西瓜汁貯藏中典型風(fēng)味物質(zhì)的變化

由表1 可知，采用400 MPa、20 min 超高壓處理西瓜汁，在4 ℃貯藏時(shí)，10 d 內(nèi)各種風(fēng)味物質(zhì)含量變化不明顯。綜合分析，采用超高壓處理西瓜汁，其風(fēng)味物質(zhì)的變化較小。貯藏期間能夠很好地保證風(fēng)味物質(zhì)的品質(zhì)。因此，超高壓技術(shù)結(jié)合低溫處理，可對西瓜汁貯藏與加工可以提供條件參考。

表1 400 MPa、20 min 超高壓處理冷藏西瓜汁在4 ℃時(shí)典型風(fēng)味物質(zhì)質(zhì)量濃度的變化Table 1 Change of typical flavor compounds content of high hydrostatic pressure treated watermelon juice during storage at 4 ℃for 400 MPa and 20 min

3 結(jié)論

本文采用超高壓處理西瓜汁，以AAT、HPL 及LOX作為測定指標(biāo)，研究了不同超高壓條件對西瓜汁低溫貯藏后香氣相關(guān)酶活的影響及變化規(guī)律，從而確定了保持西瓜汁香氣品質(zhì)的最佳參數(shù)條件。結(jié)果表明：貯藏0 d時(shí)，超高壓處理減弱了三種酶的活性，且相同的壓力下，保壓時(shí)間越久，殘存酶活性越低。而經(jīng)超高壓處理后的三種酶活性隨貯藏天數(shù)的增加先呈上升趨勢，基本在1～2 d 達(dá)到最大值，2 d 之后，酶活性隨貯藏天數(shù)的增加逐漸降低，10 d 后三種酶基本無活性。綜合以上分析，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)過程，從節(jié)約能源和提高效率方面考慮，確定超高壓處理西瓜汁的最佳參數(shù)條件是壓力400 MPa，保壓時(shí)間20 min，貯藏期1～10 d，此時(shí)西瓜汁的品質(zhì)較佳。因此，超高壓處理可以有效保證冷藏西瓜汁貯藏過程中的香氣品質(zhì)，為西瓜汁貯藏與加工技術(shù)提供理論依據(jù)。