新疆某規模化牧場中引發犢牛腹瀉的病因調查

王晨豫，胡馨勻，魏 勇，陳 杰，曹夢園，陳明杰，齊亞銀＊

1 石河子大學動物科技學院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤乳業股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

犢牛腹瀉是規模化牧場常見癥狀，引起癥狀的原因復雜，主要集中在3月齡內，致死率高。新疆晝夜溫差大，而且養殖水平相對落后，大部分牧場沒有犢牛島，在養殖生產上一旦控制不當，易造成較大的經濟損失。犢牛免疫力較弱，對外界環境抵抗力較差，極易出現腹瀉，病程為5～7天，會逐漸消磨犢牛的生命力，最后導致其脫水死亡。

造成犢牛腹瀉的主要因素有以下幾個方面。一是病毒因素，主要由輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引發。病毒引起犢牛腹瀉無明顯季節性，主要以地方性流行。當飼養密度過大，環境中懸浮顆粒較多，潮濕均有利于病毒傳播。通常由妊娠期母牛垂直傳播給犢?；驙倥ν饨绲挚沽^弱而被感染。二是細菌因素，主要是由于犢牛生存在衛生條件差、易滋生細菌和病毒的環境下而感染大腸桿菌和沙門氏菌引發。三是寄生蟲因素。主要由以隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲為代表的寄生蟲引發，且不容易被發現，往往通過母牛傳染給犢牛。四是飼養因素，主要由飼養人員在哺乳期母牛飼料調控工作方面出現差錯而引發。此外，犢牛缺乏營養也常會出現腹瀉的情況[1，2]。

本文通過對新疆某規模化牧場腹瀉犢牛糞便及血液進行檢測，查明該牧場犢牛腹瀉的病因，為該牧場的后續治療和防控提供了科學依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BVDV酶聯免疫吸附劑測定（ELISA）抗原檢測試劑盒購自IDEXX公司；PrimeScript? RT Master Mix購自TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TIANamp Virus RNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ購自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA專用氯仿、RNA專用75.00%乙醇、異丙醇等購自生工生物（上海）有限公司。犢牛腹瀉4聯抗原快速檢測試劑盒購自yoyoung公司。

1.2 樣品來源

2020年12月采集新疆奎屯地區某牧場48 份3月齡內犢牛糞便及血液，血液置于采血器中析出血清，分裝在1.5 mL離心管中放于-20 ℃保存。糞便樣品置于5 mL離心管中，4 ℃保存，運輸回實驗室，立即進行細菌試驗。試驗后糞便樣品轉至-80 ℃長期保存。

1.3 犢牛腹瀉4 聯抗原快速檢測

用棉簽蘸取糞便，插入樣品稀釋管中，混勻，使用一次性滴管吸去混合樣品上清液，緩慢滴加4 滴至測試卡樣品孔中。10 min內讀取結果。

1.4 犢牛血清BVDV抗原檢測

1．4．1 ELISA檢測

從-20 ℃冰箱取出先前采集的各牧場血清，恢復至室溫后，按照BVDV血清抗原檢測試劑盒產品說明書分別對血清和耳組織進行BVDV抗原檢測。

1．4．2 BVDV血清抗原檢測試劑盒結果判定

檢測計算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.300，判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，判為BVDV抗原陽性。

1.5 BVDV病原RT-PCR檢測

1．5．1 樣品制備

采集血清學抗原檢測陽性牛只的糞便、鼻腔分泌物，提取RNA，反轉錄成cDNA，進行RT-PCR復檢。取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后，經凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。通過膠回收目的條帶，送檢測序。

1．5．2 引物設計

根據Decaro等[3]采用的方法，設計通用檢測引物（表1），由生工生物（上海）有限公司合成。

表1 BVDV引物序列、位置及大小

1．5．3 RT-PCR擴增

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒說明書方法提取血清中的RNA，根據TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒說明書方法將提取的RNA反轉錄獲得cDNA，置于-20 ℃保存備用。

1．5．4 PCR反應體系及擴增條件

PCR反應體系及擴增條件見表2。

表2 PCR反應體系及擴增條件

反應結束后，取8 μL PCR產物經1.50%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠（EB）染色后，經凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。

2 結果

2.1 犢牛腹瀉病4聯抗原快速檢測結果

犢牛腹瀉4聯抗原快速檢測結果見表3、圖1，大腸桿菌K99陽性率為43.75%（21/48）。

表3 犢牛腹瀉4聯抗原快速檢測結果

圖1 部分犢牛腹瀉4聯抗原快速檢測結果

取大腸桿菌陽性糞便放至裝有5 mL 肉湯的培養基中，在搖床中增菌12 h，鏡檢觀察結果（圖2）。將培養后的培養液接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養12 h后，觀察結果（圖3）。

圖2 大腸桿菌陽性糞培養菌液鏡檢圖片

圖3 培養液接種于麥康凱瓊脂平板圖片

2.2 犢牛血清BVDV抗原檢測

犢牛血清共計48 份，抗原檢測結果為BVDV抗原陽性4 份，陽性率為8.33%（4/48），見表4。

表4 犢牛血清BVDV抗原檢測

2.3 BVDV RT-PCR 結果

糞便共計48 份，RT-PCR結果顯示BVDV陽性糞便為14 份，陽性率為29.17%（14/48），見圖4。

圖4 BVDV病原核酸檢測結果

2.4 BVDV陽性結果序列分析

將4 份陽性樣品的測序結果使用DNAStar Megalign軟件與BVDV基因1-NADL，全基因組M31182.1參考株進行序列對比，此次測序的4 份陽性樣品之間的同源性為97.90%～99.20%，XJB-W01株～XJB-W04株與參考基因NADL的同源性分別為67.10%、67.20%、66.70%、65.60%，屬于BVDV-1a型。使用MEGA軟件將測序的4 株BVDV基因與部分參考株做系統遺傳進化樹。結果表明，XJB19-01～XJB19-04為同一族，與參考株NADL處于同一進化分支。各毒株間的同源性均在97.00%以上；而各毒株樣品與參考基因NADL同源性均在66.00%左右，基因變異較大。同源性比較詳見圖5，系統進化樹圖譜詳見圖6。

圖5 各株基因與GenBank上參考基因的同源性比較結果

圖6 系統進化樹的構建結果

3 討論

犢牛健康是牧場長期發展的依仗，犢牛腹瀉可對牧場造成巨大的經濟損失，本試驗查明引起該牧場犢牛腹瀉的主要因素是BVDV和大腸桿菌。

BVDV感染會對奶牛養殖業造成巨大的經濟損失，需要采取有效的防控凈化措施。一是發現持續感染牛；二是根據本地本場的牛群密度和感染率來制定防控措施，采取“免疫-檢疫-淘汰”策略[4]；三是加強牧場的消毒，制定消毒程序，使用復方醛類、氫氧化鈉、生石灰對圈舍、道路、圈舍周邊綠化帶等進行定期消毒[5]。犢牛剛出生后免疫1 次哞樂優（BVDV-IBR 二連滅活疫苗），間隔1 個月后加強免疫1 次，全群在每年4—10月中普免2 次。全群每年定期做BVDV抗原檢測，將陽性或疑似陽性牛隔離，采集鼻拭子、糞便或血清送至實驗室提取RNA，使用BVDV檢測引物進行RT-PCR復檢，淘汰陽性犢牛。針對血清陽性率較高的地區，做好抗原的持續檢測，持續免疫，通過淘汰減少陽性牛以及做好綜合性生物安全安保體系，維持BVDV的凈化狀態[6]。因BVD沒有特效藥物，只能以提高牛只免疫力為主，對癥治療，即時補水，避免脫水死亡[7]。

大腸桿菌引起的犢牛腹瀉以抗生素治療為主，使用大腸桿菌敏感性抗生素，利用藥物互補增效的特點聯合用藥，從而快速控制癥狀[8]。常用于治療細菌性腹瀉的藥物有慶大霉素、土霉素、金霉素等。