新疆某規(guī)?；翀?chǎng)中引發(fā)犢牛腹瀉的病因調(diào)查

王晨豫，胡馨勻，魏 勇，陳 杰，曹夢(mèng)園，陳明杰，齊亞銀＊

1 石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832003

2 新疆天潤(rùn)乳業(yè)股份有限公司，新疆烏魯木齊 830000

0 引言

犢牛腹瀉是規(guī)?；翀?chǎng)常見癥狀，引起癥狀的原因復(fù)雜，主要集中在3月齡內(nèi)，致死率高。新疆晝夜溫差大，而且養(yǎng)殖水平相對(duì)落后，大部分牧場(chǎng)沒有犢牛島，在養(yǎng)殖生產(chǎn)上一旦控制不當(dāng)，易造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。犢牛免疫力較弱，對(duì)外界環(huán)境抵抗力較差，極易出現(xiàn)腹瀉，病程為5～7天，會(huì)逐漸消磨犢牛的生命力，最后導(dǎo)致其脫水死亡。

造成犢牛腹瀉的主要因素有以下幾個(gè)方面。一是病毒因素，主要由輪狀病毒、冠狀病毒和牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea Virus，BVDV）引發(fā)。病毒引起犢牛腹瀉無明顯季節(jié)性，主要以地方性流行。當(dāng)飼養(yǎng)密度過大，環(huán)境中懸浮顆粒較多，潮濕均有利于病毒傳播。通常由妊娠期母牛垂直傳播給犢牛或犢牛對(duì)外界抵抗力較弱而被感染。二是細(xì)菌因素，主要是由于犢牛生存在衛(wèi)生條件差、易滋生細(xì)菌和病毒的環(huán)境下而感染大腸桿菌和沙門氏菌引發(fā)。三是寄生蟲因素。主要由以隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲為代表的寄生蟲引發(fā)，且不容易被發(fā)現(xiàn)，往往通過母牛傳染給犢牛。四是飼養(yǎng)因素，主要由飼養(yǎng)人員在哺乳期母牛飼料調(diào)控工作方面出現(xiàn)差錯(cuò)而引發(fā)。此外，犢牛缺乏營(yíng)養(yǎng)也常會(huì)出現(xiàn)腹瀉的情況[1，2]。

本文通過對(duì)新疆某規(guī)?；翀?chǎng)腹瀉犢牛糞便及血液進(jìn)行檢測(cè)，查明該牧場(chǎng)犢牛腹瀉的病因，為該牧場(chǎng)的后續(xù)治療和防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

BVDV酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（ELISA）抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；PrimeScript? RT Master Mix購(gòu)自TaKaRa公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、TIANamp Virus RNA Kit購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；2×Taq Plus Master Mix Ⅱ購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；RNA專用氯仿、RNA專用75.00%乙醇、異丙醇等購(gòu)自生工生物（上海）有限公司。犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測(cè)試劑盒購(gòu)自yoyoung公司。

1.2 樣品來源

2020年12月采集新疆奎屯地區(qū)某牧場(chǎng)48 份3月齡內(nèi)犢牛糞便及血液，血液置于采血器中析出血清，分裝在1.5 mL離心管中放于-20 ℃保存。糞便樣品置于5 mL離心管中，4 ℃保存，運(yùn)輸回實(shí)驗(yàn)室，立即進(jìn)行細(xì)菌試驗(yàn)。試驗(yàn)后糞便樣品轉(zhuǎn)至-80 ℃長(zhǎng)期保存。

1.3 犢牛腹瀉4 聯(lián)抗原快速檢測(cè)

用棉簽蘸取糞便，插入樣品稀釋管中，混勻，使用一次性滴管吸去混合樣品上清液，緩慢滴加4 滴至測(cè)試卡樣品孔中。10 min內(nèi)讀取結(jié)果。

1.4 犢牛血清BVDV抗原檢測(cè)

1．4．1 ELISA檢測(cè)

從-20 ℃冰箱取出先前采集的各牧場(chǎng)血清，恢復(fù)至室溫后，按照BVDV血清抗原檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品說明書分別對(duì)血清和耳組織進(jìn)行BVDV抗原檢測(cè)。

1．4．2 BVDV血清抗原檢測(cè)試劑盒結(jié)果判定

檢測(cè)計(jì)算樣品的校正OD值。被檢樣品的S-N值≤0.300，判為BVDV抗原陰性；被檢樣品的S-N值＞0.300，判為BVDV抗原陽性。

1.5 BVDV病原RT-PCR檢測(cè)

1．5．1 樣品制備

采集血清學(xué)抗原檢測(cè)陽性牛只的糞便、鼻腔分泌物，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和EB染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。通過膠回收目的條帶，送檢測(cè)序。

1．5．2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Decaro等[3]采用的方法，設(shè)計(jì)通用檢測(cè)引物（表1），由生工生物（上海）有限公司合成。

表1 BVDV引物序列、位置及大小

1．5．3 RT-PCR擴(kuò)增

按照天根生化科技（北京）有限公司的RNA提取試劑盒說明書方法提取血清中的RNA，根據(jù)TaKaRa公司的cDNA合成試劑盒說明書方法將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．5．4 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件見表2。

表2 PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件

反應(yīng)結(jié)束后，取8 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.50%瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠（EB）染色后，經(jīng)凝膠成像掃描儀觀察目的片段大小。

2 結(jié)果

2.1 犢牛腹瀉病4聯(lián)抗原快速檢測(cè)結(jié)果

犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測(cè)結(jié)果見表3、圖1，大腸桿菌K99陽性率為43.75%（21/48）。

表3 犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測(cè)結(jié)果

圖1 部分犢牛腹瀉4聯(lián)抗原快速檢測(cè)結(jié)果

取大腸桿菌陽性糞便放至裝有5 mL 肉湯的培養(yǎng)基中，在搖床中增菌12 h，鏡檢觀察結(jié)果（圖2）。將培養(yǎng)后的培養(yǎng)液接種于麥康凱瓊脂平板上，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后，觀察結(jié)果（圖3）。

圖2 大腸桿菌陽性糞培養(yǎng)菌液鏡檢圖片

圖3 培養(yǎng)液接種于麥康凱瓊脂平板圖片

2.2 犢牛血清BVDV抗原檢測(cè)

犢牛血清共計(jì)48 份，抗原檢測(cè)結(jié)果為BVDV抗原陽性4 份，陽性率為8.33%（4/48），見表4。

表4 犢牛血清BVDV抗原檢測(cè)

2.3 BVDV RT-PCR 結(jié)果

糞便共計(jì)48 份，RT-PCR結(jié)果顯示BVDV陽性糞便為14 份，陽性率為29.17%（14/48），見圖4。

圖4 BVDV病原核酸檢測(cè)結(jié)果

2.4 BVDV陽性結(jié)果序列分析

將4 份陽性樣品的測(cè)序結(jié)果使用DNAStar Megalign軟件與BVDV基因1-NADL，全基因組M31182.1參考株進(jìn)行序列對(duì)比，此次測(cè)序的4 份陽性樣品之間的同源性為97.90%～99.20%，XJB-W01株～XJB-W04株與參考基因NADL的同源性分別為67.10%、67.20%、66.70%、65.60%，屬于BVDV-1a型。使用MEGA軟件將測(cè)序的4 株BVDV基因與部分參考株做系統(tǒng)遺傳進(jìn)化樹。結(jié)果表明，XJB19-01～XJB19-04為同一族，與參考株NADL處于同一進(jìn)化分支。各毒株間的同源性均在97.00%以上；而各毒株樣品與參考基因NADL同源性均在66.00%左右，基因變異較大。同源性比較詳見圖5，系統(tǒng)進(jìn)化樹圖譜詳見圖6。

圖5 各株基因與GenBank上參考基因的同源性比較結(jié)果

圖6 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建結(jié)果

3 討論

犢牛健康是牧場(chǎng)長(zhǎng)期發(fā)展的依仗，犢牛腹瀉可對(duì)牧場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，本試驗(yàn)查明引起該牧場(chǎng)犢牛腹瀉的主要因素是BVDV和大腸桿菌。

BVDV感染會(huì)對(duì)奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，需要采取有效的防控凈化措施。一是發(fā)現(xiàn)持續(xù)感染牛；二是根據(jù)本地本場(chǎng)的牛群密度和感染率來制定防控措施，采取“免疫-檢疫-淘汰”策略[4]；三是加強(qiáng)牧場(chǎng)的消毒，制定消毒程序，使用復(fù)方醛類、氫氧化鈉、生石灰對(duì)圈舍、道路、圈舍周邊綠化帶等進(jìn)行定期消毒[5]。犢牛剛出生后免疫1 次哞樂優(yōu)（BVDV-IBR 二連滅活疫苗），間隔1 個(gè)月后加強(qiáng)免疫1 次，全群在每年4—10月中普免2 次。全群每年定期做BVDV抗原檢測(cè)，將陽性或疑似陽性牛隔離，采集鼻拭子、糞便或血清送至實(shí)驗(yàn)室提取RNA，使用BVDV檢測(cè)引物進(jìn)行RT-PCR復(fù)檢，淘汰陽性犢牛。針對(duì)血清陽性率較高的地區(qū)，做好抗原的持續(xù)檢測(cè)，持續(xù)免疫，通過淘汰減少陽性牛以及做好綜合性生物安全安保體系，維持BVDV的凈化狀態(tài)[6]。因BVD沒有特效藥物，只能以提高牛只免疫力為主，對(duì)癥治療，即時(shí)補(bǔ)水，避免脫水死亡[7]。

大腸桿菌引起的犢牛腹瀉以抗生素治療為主，使用大腸桿菌敏感性抗生素，利用藥物互補(bǔ)增效的特點(diǎn)聯(lián)合用藥，從而快速控制癥狀[8]。常用于治療細(xì)菌性腹瀉的藥物有慶大霉素、土霉素、金霉素等。