桑屬植物葉綠體PsbA基因序列與進化分析

郭亮亮 吳萌萌 郭 鵬 鄭丹艷 趙衛國

(江蘇科技大學蠶業研究所，江蘇鎮江 212018)

隨著測序技術的不斷發展和測序成本的降低，越來越多的植物葉綠體基因組得到解析，使人們對葉綠體基因組的了解更加深入。高等植物的葉綠體基因組屬于母系遺傳，基因順序和結構具有高度保守的特性，在進化中變異緩慢[1]，是植物系統發育進化研究的重要標記[2]。近年來，已有大量的葉綠體基因組序列被廣泛研究。單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism SNP)，是指在基因組水平上由單個核苷酸變異所引起的多態性，具有密度較大、遺傳穩定、雙等位分型、自動化分型等特性，也經常被廣泛應用于遺傳育種、品種鑒定等領域。

在核糖體基因轉錄內間隔區ITS序列研究上，史全良等[3]以蒙桑為材料采用PCR產物直接測序法，測定了核糖體基因轉錄內間隔區ITS序列，基于此序列為桑屬植物進化研究提供了一定的理論依據。2004年，趙衛國等[4]以構樹為外源種用同樣的方法對桑屬植物9個種3個變種進行了核糖體基因轉錄內間隔區ITS序列的測定，試驗結果表明：桑屬植物是單系；蒙桑單獨聚為一類親緣關系最遠，鬼桑、雞桑(雅周桑)聚為一類，其它桑種聚為一類，白桑最進化。PsbA基因是存在于葉綠體中的保守基因，其功能與光合作用有關，在植物生命活動中起著至關重要的作用。本研究通過對比魯桑和廣東桑葉綠體全基因組序列，發現PsbA基因序列有SNP，可能存在進化序列，并用基因克隆的方法來做進化分析，以期為桑屬植物系統分類提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試桑屬植物材料及無花果 桑屬植物8個桑種15個品系(品種)及外源種無花果共計16份材料(表1)，均采自國家種質鎮江桑樹圃。

1.1.2 主要試劑 氯仿(分析純)、異丙醇(分析純，-20 ℃預冷)、75%冰乙醇(分析純，4 ℃預冷)、Taq酶、19-Tvector、SolutionⅠ，均購自Takara公司；植物基因組快速抽提試劑盒、DiaSpin柱式DNA膠回收試劑盒，均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 供試桑屬植物材料及無花果

品系(品種)中文名稱拉丁學名魯牛耳桑白桑Morus alba泰國桑白桑Morus alba雅安7號華桑Morus cathayana蘇湖16號魯桑Morus multicaulis節曲魯桑Morus multicaulis湖桑32號魯桑Morus multicaulis倫教40號廣東桑Morus atropurpurea雞桑雞桑Morus australis特早魯桑Morus multicaulis黑桑黑桑Morus nigra垂枝桑垂枝桑Morus alba插桑雞桑Morus australis保靖5號華桑Morus cathayana火桑瑞惠桑Morus mizuho育71-1魯桑Morus multicaulis無花果無花果Ficus carica

表中供試材料均采自國家種質鎮江桑樹圃。

1.1.3 主要儀器設備 JY300電泳儀、F3紫外凝膠成像儀，均為Gene Company Limited(基因有限公司)產品；Mastercycler nexus GX2 PCR儀、5424r臺式高速冷凍離心機、-80 ℃超低溫冰箱，均為德國艾本德股份公司產品；NanoDrop One微量核酸蛋白濃度檢測儀，為賽默飛世爾科技公司產品；HHS-21-4恒溫水浴鍋，為生工生物工程(上海)股份有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 供試的16份材料總DNA的提取使用植物基因組快速抽提試劑盒提取。

1.2.2 目的基因的確定 通過利用軟件DNAMAN對魯桑和廣東桑葉綠體全基因組序列(全基因組序列委托武漢貝納科技服務有限公司完成)對比發現，PsbA基因序列存在SNP，該基因具有AT偏好特性，其功能與光合作用有關，可能存在進化序列，因此將PsbA基因確定為本試驗的目的基因。

1.2.3 目的基因的克隆測序 根據目的基因設計上游引物(5′-ATGACTGCAATTTTAGAGAGACGC-3′)和下游引物(5′-TTATCCATTTGTAGATGGAACTTC-3′)，然后采用PCR產物回收、連接、轉化、過夜培養進行藍白斑篩選，挑選白色菌落，進行菌液培養，并送浙江尚亞生物技術有限公司測序獲得16份供試材料PsbA基因的基因序列。

1.2.4 桑屬植物的聚類分析 利用Clone Manager 8.0和MEGA 6.0軟件對16份材料的PsbA基因序列進行對比，做進化樹進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 PsbA基因序列的擴增、純化與測序

目的基因PsbA序列長度1 062 bp。對其設計引物，經過PCR產物純化、連接載體、轉化、過夜培養之后，挑選白色單菌落培養，然后進行菌液PCR驗證篩選出陽性克隆，陽性菌液送浙江尚亞生物技術有限公司進行測序獲得16份材料的PsbA基因序列，結果得出16份材料PsbA基因序列長度均在1 062 bp左右，確定為目的基因序列。

2.2 不同桑種與外源種PsbA基因序列分析

用Clone Manager 8.0軟件對獲得的16份材料的PsbA基因序列進行對比，發現同源性在89%～99%之間。通過對比發現，桑種各品系間的同源性都大于98%，說明供試材料即使桑種不同桑屬植物內部各品種的親源關系仍然較近。但是外源種無花果與供試桑種材料同源性較低，僅為89%。

2.3 供試材料PsbA基因序列密碼子分析

我們對16份供試材料的PsbA基因序列A和T含量進行了測定，15份桑屬植物A+T含量平均約為57.67%，最高的倫教40號高達58.47%，最低的插桑為57.43%，含量非常接近。但是外源種無花果A+T含量僅為49.55%，差異很大。這更加證明了桑屬植物葉綠體基因組的保守性強。15份桑屬植物材料平均核苷酸組成為A占27.48%、T占30.10%、C占20.83%、G占21.59%，由此可以看出該基因序列在桑屬植物中具有A和T偏好特性。

2.4 桑屬植物基于PsbA基因序列聚類分析

采用MEGA 6.0軟件以無花果為外源種對8個桑屬植物材料在內的16份材料通過最大簡約法(ML)做進化樹進行聚類分析，結果如圖1所示。從圖1可以看出，?？频臒o花果和桑屬植物分別單獨聚為一類。在圖1中顯示，供試桑材料中首先倫教40號、雞桑、特早、黑桑聚為一類，自檢支持率高達62%。育71-1先與火桑、保靖5號聚為一類然后再和插桑聚為一類，自檢支持率為100%。魯牛耳桑單獨聚為一類。泰國桑先和雅安7號聚為一類然后再和蘇湖16號聚為一類，說明有一定的親緣關系。

圖1 桑屬植物的葉綠體基組序列通過最大似然法進行的聚類情況

3 小結與討論

本次試驗對桑屬植物的PsbA基因序列進行了分析，發現了供試桑屬植物材料的PsbA基因同源性較高(>98%)。聚類結果也進一步證明了桑屬植物為單系，這和前人的研究結果[5-9]一致。采用葉綠體PsbA基因序列來進行桑屬植物的聚類分析，該方法得出的結論和汪偉等[10]采用trnL內含子序列對桑屬植物系統學研究有一定的相似之處，但是也有差異。試驗材料中倫教40號、雞桑、特早、黑桑聚為一類，自檢支持率高達62%，說明桑屬植物品種黑桑(黑桑)、魯桑(特早)、雞桑(雞桑)和廣東桑的親緣關系較近，這個結果和陳仁芳等[11]基于ITS分析桑屬植物親緣關系研究結果有相似之處，他也認為廣東桑和雞桑的親緣關系較近；廣東桑和雞桑分在一起和劉玲等[12]采用ITS、trnL-F和rps16序列研究桑親緣關系得出的結果有相似之處。但陳仁芳等[11]通過ITS堿基序列分析認為廣東桑、鬼桑、瑞惠桑、白桑之間存在某種關系，這與我們的研究結果略有出入，我們沒有得出廣東桑、白桑和瑞惠桑有特別近的親緣關系。白桑和雞桑親緣關系較遠，在傳統分類中，白桑、蒙桑、雞桑的形態完全不同，認為親緣關系距離較遠，這也與我們本次的研究結果一致。本試驗中雖然將黑桑和魯桑(特早)聚為一類，但是自檢支持率并不高僅為20%，這個結果與陳仁芳等[13]將黑桑單獨聚為一類(自檢支持率89%)，認為黑桑最為原始的研究結果相似。魯牛耳桑單獨聚為一類，說明本次試驗選取的白桑(魯牛耳桑)與其他品種親緣關系較遠，這個結果與汪偉等[10]基于trnL內含子對桑屬植物進化研究結果相似。在我們的研究結果中，雞桑(插桑)、華桑(保靖5號)、瑞惠桑(火桑)和魯桑(育71-1)聚為一類，自檢支持率為100%，說明親緣關系較近，但是與陳仁芳等[11]的研究結果有差異，她的結果顯示華桑、川桑、奶桑和長穗桑聚為一類。我們的研究和前人相比在研究的方法上有所不同，本次試驗以葉綠體基因序列為依據，在研究桑屬植物系統進化方面做了一個新的嘗試。我們得出的結論并不能代表最終桑屬植物分類系統，因為桑屬植物葉綠體基因組并沒有被完全測序，還有很多未知的基因需要進一步探討，關于桑屬植物系統學我們的研究還只是冰山一角，桑屬植物系統進化還需進一步研究才能得出準確的結論，本試驗研究為接下來的遺傳關系研究提供了重要的試驗數據。