十溴聯苯醚(BDE 209)暴露對孕期大鼠和胎鼠甲狀腺激素干擾效應研究

程瑩,李思思,劉曉暉,李亞晨,邵靜,胡宏

1. 大連醫科大學公共衛生學院，勞動衛生與環境衛生教研室，大連 116044 2. 大連醫科大學附屬第二醫院檢驗科，大連 116027 3. 大連醫科大學中山學院，大連 116085

阻燃劑是一類能夠阻止聚合物材料引燃或抑制火焰傳播的助劑，其種類繁多，但以溴系有機阻燃劑、尤其以多溴聯苯醚(polybrominated diphenyl ethers, PBDEs)最具代表性。PBDEs與其產品以非共價方式結合，在使用及處理回收時，可通過揮發、燃燒或與空氣污染物形成復合顆粒物等方式存在于環境中，并隨環境介質遠距離遷移，導致全球性環境污染[1]。目前育齡婦女的脂肪、血液、胎盤，哺乳期乳汁，以及胚胎肝臟和新生兒臍血中均已檢出PBDEs多種同系物的存在；特別是胎盤PBDEs負荷遠高于胚胎肝臟，且逐年增高，成為僅次于母血的PBDEs積攢地[2-5]。這提示PBDEs對胚胎發育可能產生潛在危害，日后發展為嬰幼兒、兒童甚至是成人疾病的基礎。

動物研究顯示，PBDEs具有發育神經毒性[6]，盡管目前人群流行病學調查證據有限，但仍顯示出孕期PBDEs暴露與出生兒童的神經發育動作和智力障礙具有相關性[7-10]。當前，針對PBDEs發育神經毒性研究已得到相當規模的開展，結果也頗為一致，然而其毒作用機制仍需進一步探討。孕期PBDEs暴露對子代也具有甲狀腺激素(thyroid hormone, TH)干擾效應，結局表現為類似臨床或亞臨床甲狀腺功能減退(甲減)[11]。而妊娠早期，即胎腦發生、發育的關鍵期，甲減會導致子代出現不可逆的腦損傷，表現為智力缺陷、活躍、認知障礙和適應能力下降等[12-13]，這與孕期PBDEs暴露導致的子代神經發育毒性效應頗為相似。因此，有觀點認為PBDEs發育神經毒性可能由TH干擾(甲減)所致，無疑為PBDEs發育神經毒性機制研究提出一個重要探索方向。

十溴聯苯醚(BDE 209)是PBDEs家族中含溴原子數量最多的同系物，由于其阻燃效率高、添加量較少及急性毒性相對低等特點而應用最廣[14]。我國BDE209污染情況較為嚴重[15]。且2015年的一項研究顯示，BDE 209是我國松花江流域地表沉積物中PBDEs的主要同系物，占PBDEs總量的80%以上[16]，提示其存在潛在危害。針對BDE 209孕期暴露對子代TH的干擾研究目前尚不深入，還需進一步研究。

目前對于PBDEs誘導的TH干擾效應已經在多種生物體系(細胞、動物甚至人)中得到證實[17-19]。然而，迄今多數研究是通過對出生時或出生后子代血循環TH水平的檢測進行推論，我們尚未發現PBDEs對孕早期胚胎TH干擾表型的直接研究。而孕早期胚胎在TH來源和調節機制上具有特殊性，出生后結果并不能反映孕早期TH真實狀態。而BDE 209對于出生后子代發育神經損傷效應，本課題組前期研究已發現三代小鼠BDE 209染毒能夠影響子代發育，降低子代空間學習記憶能力和空間位置記憶能力；本課題組也曾評價孕中期女性羊水PBDEs水平及其與TH干擾的潛在關系，但尚未建立完整出生隊列以確定對出生子代的發育損傷[20]。因此，本研究以大鼠為研究對象，建立大鼠孕期BDE 209暴露模型，著重觀察BDE 209對孕早期大鼠胚胎和胎腦TH干擾表型，并檢測胎腦組織形態學改變，為深入研究BDE 209的TH干擾效應提供基礎依據，并為進一步探索孕期BDE 209暴露誘導的TH干擾效應與其發育神經毒性的內在聯系提供研究基礎。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與試劑

儀器：T100TM Thermal Cycler梯度PCR儀(Bio-RAD，美國)；TP800實時PCR儀(TaKaRa，日本)；3550酶標儀(Thermo，美國)。

試劑：BDE 209(純度>99%，上海阿拉丁試劑公司，中國)，Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR(湖南艾科瑞生物工程有限公司，中國)；RNAiso Plus、SYBR qPCR Master Mix(南京諾唯贊生物技術有限公司，中國)；大鼠三碘甲狀腺原氨酸(TT3)、總甲狀腺激素(TT4)、游離甲狀腺素(FT3)、游離甲狀腺素(FT4)和促甲狀腺素(TSH)免疫試劑盒(上海朗頓生物科技有限公司，中國)；其他試劑均為分析純，購于中國天津科密歐化學試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 BDE 209孕期染毒大鼠模型建立及生物材料采集

(1)動物模型建立：實驗動物均在大連醫科大學重大疾病基因工程模式動物研究所維護及喂養。10周齡Wistar雌性大鼠24只，稱取體質量后排序，按照隨機數字表法隨機分為3組(對照組、低劑量和高劑量組，每組8只)，不同劑量組間母鼠體質量差異無顯著性(P>0.05)。選擇階段合籠法與10周齡Wistar雄鼠按照雌∶雄=2∶1合籠交配，次日清晨檢查陰道涂片，發現精子則記為妊娠第0天(GD0)。避光稱取一定量BDE 209粉末溶于花生油中，渦旋搖勻。根據孕鼠體質量，按分組劑量染毒如下：對照組(花生油)、低劑量組(100 mg·kg-1bw)、高劑量組(300 mg·kg-1bw)[15]。染毒采用每天避光灌胃一次，最長至GD20(仔鼠出生前一天)。所有動物均自由進食、飲水；室內溫度20～25 ℃、濕度40%～70%、光照按亮/暗12 h循環。

(2)生物樣品采集：在GD15和GD20這2個時間點，4%水合氯醛麻醉母鼠，剖開子宮，小心吸取羊水(作為一個獨立樣本)至無菌管并放入液氮中速凍，標記后轉入-80 ℃冰箱保存，用于羊水TH水平測定；記錄每窩胚胎大鼠體質量；GD20胎鼠每窩斷頭后取血(作為一個獨立樣本)，室溫靜置10 min后，2 500 r·min-1離心20 min，吸取上層血清，標記后轉入-80 ℃冰箱保存，用于GD20胎鼠血清中TH水平測定；采集GD15和GD20胎腦組織，用于檢測胎腦下丘腦-垂體-甲狀腺素軸(hypothalamic-pituitary-thyroxine axis，HPT軸)功能變化；采集GD20胎腦，浸泡于4%多聚甲醛溶液中24 h，隔日換液，用作孕后期胎腦形態學檢測。

1.2.2 RT-qPCR

本研究通過檢測不同胚胎發育時期胚胎大鼠腦組織促甲狀腺激素釋放激素(thyrotropin-releasing hormone, Trh)的表達，觀察孕期BDE 209暴露對胎腦HPT軸功能的影響，初步分析其在胎鼠循環和干擾胎腦組織TH中的作用。

(1)總RNA提取及質量控制：取出適量-80 ℃凍存組織，用500～1 000 mg·mL-1Trizol將稱量質量后的組織置于4 mL無菌管中，高速研磨20 s。冰上靜置10 min后轉移至1.5 mL離心管中，4 ℃、2 500 r·min-1離心5 min。吸取上清至新的1.5 mL離心管中置于冰上。按照RNAiso Plus試劑盒(南京諾維贊公司，中國)說明書，提取總RNA，通過紫外吸收值A260/280進行質量控制。A260/280比值在1.8～2.0之間時，可進行后續實驗。

(2)RNA反轉錄：按照Evo M-MLV RT Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒說明書常規操作，將總RNA反轉錄為cDNA，反轉錄條件為37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ ∞。

(3)引物設計和合成：大鼠來源GAPDH和Trh引物系委托大連萬澤貿易有限公司設計合成。名稱和序列詳見表1。

(4)PCR反應：根據SYBR qPCR Master Mix試劑盒配制20 μL體系上機反應。反應條件為預變性95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s。

(5)結果分析：應用TP800 v4.01軟件，以GAPDH表達量對mRNA表達進行標準化。實驗重復3次以上。

1.2.3 ELISA

從-80 ℃冰箱中取出組織樣品，2 500 r·min-1離心20 min，上清轉移至新1.5 mL離心管中，組別中上樣量不足時吸取各組最低量后加入同等量三蒸水補齊。由4 ℃冰箱中取出試劑盒，置于室溫平衡30 min以上。按照試劑盒說明書操作。在450 nm波長處測定各孔的OD值。根據標準品濃度及各孔OD值繪制標準曲線，將各樣品孔OD值帶入公式，計算樣品濃度。實驗重復3次。

表1 大鼠mRNA表達引物序列Table 1 Primer sequences for mRNA expression in fetal rats

1.2.4 HE染色

將固定好的GD20胎鼠腦組織取出后放入包埋盒中，按照分組情況以序號標記。從低濃度酒精(40%)開始向高濃度酒精依次脫水，再將其依次置于二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中透明。將已透明的組織塊用鑷子小心夾取，大腦皮層朝上置于已溶化好的石蠟中，放入冷卻箱中冷卻。待石蠟完全凝固取下組織蠟塊，固定在切片機載物臺上，切片的厚度為3 μm。將切好的蠟片置于50 ℃溫水中，待蠟片平展后，用防脫載玻片撈出，70 ℃烤箱烤片，干燥后可置于37 ℃恒溫箱備用。染色時經二甲苯逐級脫蠟過酒精后清洗，經蘇木素、伊紅染色，逐級酒精脫水，用中性樹膠封片，干燥后蓋片，在光學顯微鏡下觀察。

1.3 統計分析

本實驗所有數據均來源于至少3次獨立實驗，所有結果以“均值±標準差”表示，統計分析軟件為SPSS 13.0，統計分析方法采用方差分析(ANOVO)檢驗。按檢驗水準α=0.05，P<0.05差異有統計學意義。

2 結果(Results)

2.1 孕期BDE 209暴露對胚胎大鼠生長發育狀況的影響

大鼠2月齡時性成熟，妊娠期(GD)通常為19～22 d。GD15為胎鼠甲狀腺功能完全建立之前，GD20時胎鼠甲狀腺功能基本達到高峰[21-22]。因此，本實驗選取GD15和GD20這2個時間點進行相關生物樣品采集和檢測。由表2可知，GD15低劑量組胎鼠體質量與對照組差異不明顯，高劑量組胎鼠體質量與對照組相比明顯升高(P<0.01)；GD20低劑量組胎鼠體質量相比對照組亦有下降趨勢，但無統計學意義(P>0.05)，高劑量組體質量則顯著低于對照組(P<0.01)。

2.2 孕期BDE 209暴露對羊水和胎鼠血清TH水平的影響

在GD15和GD20采集孕鼠子宮羊水，并在GD20剝離胎鼠，斷頭取血。GD15仔鼠胚胎由于個體較小，無法采集其血液，故僅收集GD20胎鼠外周血液。對羊水和外周血TH的評價指標包括TT3、FT3、TT4、FT4和TSH。

2.2.1 孕期BDE 209暴露對GD15羊水TH的影響

如表3所示，GD15羊水中TT3含量有升高趨勢，尤其低劑量組，但未見顯著性差異；而FT3含量在低、高劑量組均有下降趨勢，但與對照組無顯著性差異。TT4和FT4含量在低、高劑量組均有升高趨勢，尤其FT4差異具有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。TSH在高劑量組水平上升，與對照組之間未見統計學差異。

2.2.2 孕期BDE 209暴露對GD20羊水和胚胎大鼠外周血TH的影響

GD20羊水TH水平由表4所示，BDE 209低劑量組TT3水平有增高趨勢，但未見顯著差異；FT3水平在BDE 209低、高劑量組均出現降低，且具有統計學意義(P<0.05)。TT4水平則與GD15時相反，與對照組相比略有下降趨勢，但無統計學意義；FT4水平與GD15的表現一致，有上升趨勢，在高劑量組有明顯差異(P<0.05)；而TSH水平明顯增高，在低劑量組和高劑量組均有統計學意義(P<0.05)。

GD20胚胎大鼠外周血TH水平如表5所示，TT3水平在低劑量組雖然有所降低，但與對照組相比無顯著差異；FT3水平與同時期羊水中的變化趨勢一致(表4)，具有下降趨勢，尤其在低劑量時，但未見統計學意義。TT4和FT4具有下降趨勢，但未見統計學意義。TSH水平逐漸升高，高劑量組具有統計學意義(P<0.05)，這與同時期羊水中的情況類似。

表2 大鼠孕期BDE 209暴露對胚胎大鼠體質量的影響Table 2 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the body mass of fetal rats

表3 大鼠孕期BDE 209暴露對GD15羊水甲狀腺激素(TH)的影響Table 3 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid thyroid hormone (TH) level on GD15

表4 大鼠孕期BDE 209暴露對GD20羊水TH的影響Table 4 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the amniotic fluid TH level on GD20

2.3 孕期BDE 209暴露對胚胎大鼠腦組織Trh基因表達的影響

通過觀察孕期BDE 209暴露對不同胚胎發育時期胎腦Trh表達的影響，初步分析HPT軸功能損傷在PBDEs致胎鼠循環和胎腦組織TH干擾的可能作用。

GD15和GD20胎腦Trh基因表達如圖1所示，正常胎腦(對照組)在孕期不同時期Trh基因表達相對穩定(表6)；BDE 209孕期暴露可顯著抑制胎腦Trh表達，且隨著孕期進程，對Trh抑制程度加深。低劑量組TrhmRNA水平在GD15時是對照組的68.85%(P<0.05)，在GD20時是對照組的57.53%(P<0.05)；高劑量組TrhmRNA水平在GD15時是對照組的79.44%，在GD20時是對照組的62.17%(P<0.05)。這提示，孕期BDE 209持續暴露對Trh具有進行性抑制作用(表7)。

2.4 孕期BDE 209暴露對胚胎大鼠腦組織形態學的影響

由于GD15胎鼠胎腦較小且含水量較多，受HE染色時脫水等可操作條件的限制，檢測GD15胎鼠腦組織發育形態學改變較為困難。因此，只選擇GD20胎腦觀察。如圖2所示，對照組胎腦細胞較為完整，細胞形態正常，未見明顯病理性改變。低劑量組胎腦與對照組相比也未見明顯形態學改變。高劑量組胎腦與對照組相比，出現局域性腦細胞排列明顯稀疏、核固縮和細胞間隙增大現象?？梢?，孕期BDE 209可引起胎鼠腦組織病理損傷，使孕末期胎鼠腦細胞結構發生變化，細胞數量減少，腦組織出現萎縮，可能影響后代學習和記憶能力。

圖1 大鼠孕期BDE 209暴露對GD15和GD20 大鼠胎腦Trh mRNA表達的影響注：*P<0.05，與對照組相比。Fig. 1 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the Trh mRNA expression in fetal brain on GD15 and GD20Note: *means P<0.05 compared with the control.

表5 大鼠孕期BDE 209暴露對GD20胚胎大鼠血清TH的影響Table 5 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on the serum TH level of fetal rats on GD20

表6 對照組胚胎大鼠腦組織Trh基因表達Table 6 Trh gene expression in the brain of control fetal rats

表7 大鼠孕期BDE 209暴露對胚胎大鼠腦組織Trh基因表達的影響Table 7 Effect of BDE 209 exposure during pregnancy on Trh gene expression in the fetal rat brain

圖2 大鼠孕期BDE 209暴露對GD20胎腦發育形態學影響注：C對照組；L低劑量組(100 mg·kg-1 bw)；H高劑量組 (300 mg·kg-1 bw)；放大倍數100倍和200倍。Fig. 2 Representative morphological changes induced by BDE 209 exposure during pregnancy on GD20 fetal rat brainsNote: C represents control; L represents low dose group (100 mg·kg-1 bw); H represents high dose group (300 mg·kg-1 bw); magnifications is 100 or 200.

3 討論(Discussion)

TH可調節大腦皮層海馬區的膽堿能和多巴胺能系統的發育，對于促進機體正常新陳代謝，維持機體骨骼和神經系統的生長發育具有重要意義。而在孕早期(即胎腦發生發育關鍵期)，TH對胎腦發育和成熟起著關鍵作用。大量研究顯示，PBDEs具有TH干擾毒性效應，如損傷甲狀腺形態、改變TH水平、高親和力結合TH轉運蛋白拮抗TH等[23-24]。而甲狀腺功能的微小改變就可能對人體健康，特別是神經系統發育產生影響。

目前有關孕期PBDEs暴露對胎鼠TH干擾的評價，多是通過對出生子鼠循環TH水平的檢測結果進行間接/回顧性推測[17,25]，直接研究尚未見報道。有研究認為，羊水TH水平與臍血激素水平有一定的相關性，反映了胎兒TH的代謝，而與孕婦血激素濃度相關性不強。因此，羊水TH可能是反映胎兒甲狀腺功能的較好指標[26]。在本實驗中，孕早期(GD15)BDE 209暴露可導致羊水FT4顯著升高，并有一定的劑量-效應關系，同時TT4水平也有升高的趨勢，盡管與對照相比沒有顯著差異。這提示，BDE 209暴露可導致孕早期胚胎處于高TH狀態(類T4甲亢)。而在孕末期(GD20)，羊水FT4水平回降至與對照相比差別不大，雖然在高劑量組仍有顯著升高；FT3水平在低、高劑量組均出現顯著降低；TSH水平顯著升高，這表明胎腦垂體對胚胎循環TH水平變化的抵抗。GD20胎鼠血清循環TH水平總體變化趨勢與同時期羊水TH動態變化基本一致，TSH水平升高，孕末期羊水FT3水平明顯降低，且在GD20胎鼠血清中也顯著下降，可能由于BDE 209損傷中樞HPT軸，導致胎鼠甲狀腺T3生成不足所致。結果提示，孕末期胎鼠可能處于中樞性甲狀腺功能減退狀態。文獻報道，孕期BDE 209暴露(300 mg·kg-1bw)可導致出生子鼠出生后20 d(PND20)血清T3水平下降，TSH水平升高[27]，這與本研究結果基本一致。孕早期胚胎在TH來源和調節機制上具有特殊性。在來源方面，孕(早)期胚胎甲狀腺功能尚未建立完全，其主要依賴于母體循環TH；在調節機制方面，來自母體的高濃度TH需要胎盤脫碘酶3(Dio3)調節，將細胞外T3和T4滅活，以保證胎兒TH處于最佳生理水平[28]。我們在前期研究中發現，PBDEs可誘導小鼠胎盤Dio3表達下調，并可能與其發育神經毒性效應有關[11]。結合PBDEs在胎盤蓄積程度，我們推測，PBDEs可能通過抑制胎盤Dio3活性，干擾胚胎TH。而TH對胚胎發育過程和結局起關鍵作用，無論甲亢或甲減均可導致胚胎發育損害。在本實驗中，BDE 209孕期高劑量暴露可導致GD15胎鼠體質量升高，而GD20胎鼠體質量降低，這可能因為BDE 209對孕早、晚期胚胎TH的干擾表型存在差異，同時可能也與BDE 209或其代謝產物在胎鼠體內持續蓄積有關，導致不同發育窗口對生長發育影響的結局不同。

胎兒下丘腦在其自身HPT軸發育、成熟的過程中發揮重要的作用，且在孕晚期，胎腦HPT軸發育基本成熟，對胚胎循環和胎腦TH調節也有重要作用[29]。因此，本研究通過檢測不同時期胎腦促甲狀腺激素釋放激素(Trh)的表達，觀察孕期BDE 209暴露對胎腦HPT軸功能的影響，分析其在胎鼠循環和胎腦組織TH干擾中的作用。研究結果顯示，孕早期BDE 209暴露導致胎腦(GD15)Trh的表達顯著下調，表明在孕早期胎鼠下丘腦功能已受損。在孕末期，胎鼠本身HPT軸的功能基本成熟，TH主要來自其自身甲狀腺的分泌，循環TH水平可能取決于BDE209對中樞HPT軸功能的損傷程度。如果HPT軸功能失調，可能影響下丘腦Trh的生成和釋放，抑制垂體對Trh的反應或TSH活性成熟過程，導致T3、T4生成不足而在血循環的水平下降，而TSH水平可能出現下降、不變或上升，這與Trh或Trh受體基因敲除小鼠的實驗結果相似[30]，也與上述孕末期羊水和胎鼠血清中的TH干擾的表型基本一致。

除了前述一系列功能指標，BDE 209對胎鼠腦組織形態學的改變，是評價其毒性效應不可或缺的指標。目前，針對PBDEs的TH干擾及發育神經毒性研究多數通過對出生子代神經行為、認知能力和學習記憶等損傷效應進行探討，涉及體內胎腦的病理變化和分子通路的研究較少。本研究通過觀察GD20胎鼠胎腦形態學的改變，發現孕期BDE 209暴露可引起孕后期胎鼠腦細胞結構發生變化，細胞數量減少，腦組織出現萎縮，從而影響出生子代神經行為、學習和記憶能力。日后，可對胎腦各功能區域細致分區，并檢測胚胎腦組織TH信號傳導分子表達，進一步探討孕期BDE 209暴露對于后代的毒性效應。

目前對于PBDEs毒性作用研究還較為獨立，而神經發育缺陷的重要機制之一即為TH水平不平衡，這提示，PBDEs誘導的TH干擾與發育神經毒性之間可能存在內在關聯。孕期是生命的初始，與生命質量關系密切。因此，深入研究PBDEs毒性效應的內在聯系，找出特異性作用靶點即生物標志物，對防治PBDEs造成的早期健康損害具有深遠意義，是目前急需重視的研究方向。