一種透射電鏡離散細(xì)胞的樣品制備法

孫竹林 姬 曼 趙君朋

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室電鏡室，北京 100069)

透射電鏡(Transmission Electron Microscopy TEM)是生命科學(xué)領(lǐng)域超微形態(tài)學(xué)研究的重要手段。TEM生物樣品制備過程復(fù)雜且步驟繁多，因此樣品制備對(duì)實(shí)驗(yàn)的成敗至關(guān)重要。其中離散細(xì)胞樣品(如血液，胸腹水樣本等)因其細(xì)胞數(shù)量少、且相對(duì)分散，這類樣品的收集制備一直是個(gè)難題[1-3]。以往，離散細(xì)胞樣品通常采用離心沉淀法先將細(xì)胞懸浮后離心，積聚成團(tuán)塊再進(jìn)行常規(guī)電鏡制備[1]。此方法一般要求有足夠的細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞離心后易成團(tuán)且比較牢固，不然制備過程中經(jīng)多次換液、離心處理后很難得到足量細(xì)胞樣品，最終導(dǎo)致制樣無預(yù)期結(jié)果[1-4]。有研究用明膠預(yù)包埋法處理離散細(xì)胞樣品，但該方法的明膠溫度難以控制，容易造成細(xì)胞變形等問題[2-4]。本研究采用天然蛋白膠體(蛋清)對(duì)離散細(xì)胞樣品進(jìn)行預(yù)包埋處理，既易保存樣品原有數(shù)量，又不影響固定包埋效果。

1 材料和方法

1.1 材料

試劑：2.5%戊二醛；1%鋨酸；0.1mol/L 磷酸緩沖液；spon812樹脂；乙醇；環(huán)氧丙烷。

儀器：透射電子顯微鏡1400Plus；超薄切片機(jī)UC6；全自動(dòng)組織處理機(jī)EM TP；烤片臺(tái)；烤箱。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞的收集

分別取大鼠骨髓全血和血管平滑肌細(xì)胞懸液各1.5mL入尖底離心管，離心15min(1500轉(zhuǎn)/min)棄上清。

1.2.2固定與漂洗

加2.5%戊二醛固定液(4℃預(yù)冷)固定1h。適量0.1mol/L 磷酸緩沖液漂洗3次，每次5min。

1.2.3預(yù)包埋

首先將已處理的細(xì)胞團(tuán)吸取至濾紙上吸干水分，隨后取新鮮雞蛋開小孔，吸取適量蛋白(蛋清),滴于預(yù)熱的載玻片表面(約50μL/滴)，待蛋白微凝時(shí)(呈灰白色)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至蛋白凝塊，使其包埋于其中，再次將載玻片置烤片臺(tái)上加熱至蛋白完全凝固狀態(tài)(呈白色)。

1.2.4后固定

將預(yù)包埋后的細(xì)胞白色混凝團(tuán)轉(zhuǎn)入1%鋨酸固定液中固定1h(4℃)。隨后再次漂洗，條件同上。

1.2.5脫水滲透

經(jīng)梯度乙醇50%、70%、90%、100%和環(huán)氧丙烷逐級(jí)脫水處理后(5min/次，各級(jí)2次)，再經(jīng)spon812環(huán)氧樹脂:環(huán)氧丙烷1∶1、3∶1，各40min，最后純樹脂浸透2h。

1.2.6包埋聚合

將樣品轉(zhuǎn)移至包埋模具中，置恒溫干燥箱中升溫聚合。聚合溫度與時(shí)間分別為37 ℃，12h；45℃，12h；60℃，48h。

1.2.7切片染色

聚合后的包埋塊經(jīng)超薄切片機(jī)制備100nm超薄切片，置銅網(wǎng)上。先后用醋酸雙氧鈾15min、檸檬酸鉛3min雙染色。

1.2.8電鏡觀察

采用透射電鏡1400Plus于100kV觀察，分析軟件收集圖像。

2 結(jié)果

2.1 未預(yù)包埋組

兩組細(xì)胞經(jīng)過逐級(jí)脫水、滲透等步驟后，大部分已丟失，經(jīng)包埋聚合，因殘留樣品太少，不能滿足修塊、切片的要求，無法進(jìn)行超薄切片觀察。

2.2 預(yù)包埋組

2.2.1骨髓細(xì)胞組樣品

透射電鏡下可見細(xì)胞呈集中分布，細(xì)胞間干凈，種類豐富，形態(tài)多樣，紅細(xì)胞呈扁平狀、淋巴細(xì)胞可見明顯偽足樣突起；樣品圖像反差明顯，分辨率清晰，細(xì)胞間蛋白組織未見電子反差的異常現(xiàn)象(圖1A)。超微結(jié)構(gòu)觀察可見各類細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保存良好，細(xì)胞及細(xì)胞器的膜性結(jié)構(gòu)完整，核膜及染色質(zhì)清晰可見(圖1B)。

2.2.2血管平滑肌細(xì)胞組樣品

電鏡下可見樣本背景清晰整潔，細(xì)胞亦呈集中分布，細(xì)胞間距合理，無擠壓、破損等形變，細(xì)胞間可見蛋白纖維，反差正常，對(duì)結(jié)構(gòu)觀察無干擾(圖2A)；超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞膜清晰可見，表面的微絨毛突起，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整；細(xì)胞核、核膜及染色質(zhì)均完整清晰(圖2B)。

圖1 預(yù)包埋組骨髓細(xì)胞透射電鏡圖

由圖1可知，預(yù)包埋組骨髓細(xì)胞(圖1 A )細(xì)胞結(jié)構(gòu)反差明顯，分辨率清晰，細(xì)胞間未見電子反差的異常現(xiàn)象(bar=2μm)；超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞膜清晰可見(圖1B)，表面的突起，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整(bar=0.5μm)。

圖2 預(yù)包埋組血管平滑肌細(xì)胞透射電鏡圖

圖2表明，預(yù)包埋組血管平滑肌細(xì)胞 (圖2A)細(xì)胞集中分布，細(xì)胞間距合理，無擠壓、破損等形變，細(xì)胞間可見蛋白纖維，反差正常(bar=2μm)；超微結(jié)構(gòu)觀察細(xì)胞膜清晰可見(圖2B)，表面的微絨毛突起，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整；核膜及染色質(zhì)對(duì)比清晰(bar=0.5μm)；

3 討論

蛋清是由蛋白質(zhì)組成的透明的膠狀物質(zhì)，遇熱后會(huì)凝固成白色固體故又稱為蛋白。其主要成份為卵白蛋白，卵粘蛋白等。天然卵白蛋白加熱時(shí)膠體變性凝固，卵粘蛋白熱穩(wěn)定性較強(qiáng)且具有較高的溶解度。因此，蛋清膠體熱變性微凝時(shí)，形成海綿狀凝膠，具有通透、保濕及防震保護(hù)的作用[5]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋清包埋離散細(xì)胞樣品中細(xì)胞呈集中分布，說明蛋白膠體易于細(xì)胞粘附，起到良好的聚集作用。包埋樣品處理過程中脫水完全、滲透充分，電鏡下觀察細(xì)胞膜完整，細(xì)胞偽足或突起無損傷形變，超微結(jié)構(gòu)保存效果良好，說明蛋白膠體通透性良好，且具有保護(hù)細(xì)胞表面的功能[5]。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示：包埋膠體蛋白未與樹脂及染色顆粒發(fā)生化學(xué)變化，超薄切片厚度均勻穩(wěn)定，質(zhì)量滿意。經(jīng)醋酸鈾及檸檬酸鉛染色后，蛋白無異常，細(xì)胞分辨率和反差效果均良好。為了獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)驗(yàn)中需注意的以下事項(xiàng)：首先要使用新鮮蛋白，4℃儲(chǔ)存蛋清不易凝固，影響包埋效果；其次，預(yù)包埋過程中，注意掌握凝固顏色和狀態(tài)，蛋清由微黃色變成灰白色時(shí)，為膠體微凝狀態(tài)，黏度適中有利于離散細(xì)胞的粘附與包裹；再者，制備過程中要避免牽拉、擠壓或沖擊等外力直接作用于包埋膠體，造成蛋白包埋體開裂分散。如可用木簽或細(xì)針頭輔助完成膠體包埋和轉(zhuǎn)移，脫水、滲透等環(huán)節(jié)可使用樣品處理儀替代人工換液。

該方法無需設(shè)備和試劑投入，具有簡便快捷、易于操作、適用于多種細(xì)胞且效果顯著等優(yōu)點(diǎn)，為離散細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的研究提供了一個(gè)實(shí)用、廉價(jià)的樣品制備方法。