全自動氨基酸分析儀法同時測定復方α-酮酸片中的5種氨基酸含量

(煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，煙臺 264000)

復方α-酮酸片為多種酮酸、羥酸及氨基酸組成的復方制劑，臨床上主要用于治療慢性腎功能衰竭、延緩腎衰進展、糾正代謝紊亂等。對于慢性腎衰患者，服用復方α-酮酸片可以有效的增加營養，改善糖尿病腎病患者的腎功能，對血糖、血壓水平具有一定的控制作用，安全性較好[1，2]。該藥物的作用機理主要是通過減少飲食對蛋白的攝入，進而減少體內肌酐的合成速度，將非必需氨基酸轉化成為必需氨基酸，從而達到輔助治療的目的[3，4]。復方α-酮酸片中酮酸和羥酸以鈣鹽的形式存在，5種氨基酸分別為醋酸賴氨酸(lysine acetate，LYS)、蘇氨酸(threonine，THR)、色氨酸(tryptophan，TRY)、組氨酸(histidine，HIS)、酪氨酸(tyrosine，TYR)。文獻報道中，對于5種游離氨基酸的含量測定多使用柱前衍生化的方法，衍生試劑多采用2，4-二硝基氟苯(FDNB)、鄰苯二甲醛(OPA)和 2-巰基乙醇等，衍生化試劑毒性大，衍生過程對于時間和溫度的要求較為嚴苛，而衍生過程的優異直接影響氨基酸含量測定結果[5-10]的準確性。此外，國家藥品監督管理局收載的國家藥品標準中對于復方α-酮酸片中五種氨基酸的含量測定的方法描述，存在步驟復雜并需使用高性能的液相色譜儀、或描述簡略、或無法同時測定五種氨基酸成分等問題[11-13]。目前，隨著檢驗檢測技術的進步，全自動氨基酸分析儀法因其自帶衍生系統，大大簡化了樣品的處理步驟，有效降低了處理過程中產生的誤差，該技術已廣泛應用于食品檢驗、臨床檢驗等方面[14-19]，但在藥品檢驗行業還需進一步擴大和深入。文獻報道中對于復方α-酮酸片的測定多采用HPLC法、雖能同時測定5種氨基酸的含量，但實驗過程中需使用劇毒性的衍生試劑進行衍生化操作，風險較大[7-10]。本試驗建立的氨基酸分析儀的測定方法，消除了各樣品由于衍生時間和溫度等因素的差異帶來的誤差，不但能夠同時測定復方α-酮酸片中的5種氨基酸含量，而且還具有簡單、快速、衍生劑不直接進柱等優點。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

XPE205DR電子分析天平；S-433D氨基酸分析儀，包括自動進樣系統、泵系統、溫控分離及柱后衍生系統、檢測系統、工作站等；層析柱：陽離子交換色譜柱 LCA K07/Li(4.6×150mm)。

1.2 試劑

醋酸賴氨酸對照品(批號:140802-202003，含量99.8%)、色氨酸對照品(批號：140686-201904，含量99.9%)、蘇氨酸對照品(批號：140682-201302，含量99.9%)、鹽酸組氨酸對照品(批號：140693-201904，含量99.9%)、酪氨酸對照品(批號：140609-201914，含量99.9%)均購自某食品藥品檢定研究院；17種氨基酸混標液(批號：SLBZ9656)；茚三酮(貨號：S000027CN)購自科學儀器公司。其他試劑均為分析純試劑。復方α-酮酸片：藥業公司(批號：52006015，薄膜衣片，規格：每片0.63g)；復方α-酮酸片：醫藥公司(批號：81PA008、81PC087，薄膜衣片，規格：每片0.63g)。

2 方法和結果

2.1 測定條件

氨基酸分析儀的流動相：A相為檸檬酸鋰(0.12 N，pH 2.90)、B相為檸檬酸鋰(0.2 N，pH 4.20)、C相為檸檬酸鋰(0.3 N，pH 8.00)，D相為鋰再生液(0.45 N/Li)；流速：緩沖泵0.45 mL/min，緩沖泵的梯度洗脫程序為：0 min：80% A + 20% B；3 min：79% A + 21% B；8 min：61% A + 39% B；20 min：43% A + 57% B；32 min：100% B；38 min：100% C；43 min：76% C + 24% D；57 min：76% C + 24% D；57.10 min：100% D；61.10 min：100% D，61.20 min：100% A；73 min：100% A。

柱溫箱溫度程序為：0 min：42 ℃；25 min：42 ℃；40 min：60 ℃；46 min：74 ℃；62 min：74 ℃；68 min：42 ℃；73 min：42 ℃。

茚三酮衍生泵流速為0.25 mL/min，時間為60 min，反應器溫度為130 ℃。

檢測器為紫外檢測器，波長為570 nm和440 nm。進樣量50 μL。

2.2 溶液的制備

對照品溶液的制備 分別取醋酸賴氨酸對照品、蘇氨酸對照品、色氨酸對照品、鹽酸組氨酸對照品、酪氨酸對照品，精密稱定，加20 mol·L-1的鹽酸溶液溶解并稀釋制成濃度為醋酸賴氨酸1065.1 mg·L-1、蘇氨酸586.2 mg·L-1、色氨酸244.0 mg·L-1、組氨酸386.3 mg·L-1、酪氨酸300.7 mg·L-1的混合對照品儲備溶液。精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

供試品溶液的制備 取本品適量，研細，精密稱取細粉10.52 mg，置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻作為供試品儲備溶液。精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

空白輔料溶液：按處方精密稱取不含上述5種氨基酸的空白輔料，置100 mL容量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液60ml，超聲15 min，放冷，用20 mol·L-1的鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 系統適用性及專屬性試驗

分別取2.2節的對照品溶液、混合標準品溶液、供試品溶液按2.1節的色譜條件，進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。從圖1A、B可以看出，在2.1所示色譜分析條件下，混合對照品中的五種氨基酸和供試品中的五種氨基酸均能實現基線分離，且分離度均大于1.5。圖1C顯示，空白輔料中不存在干擾峰，可見本品的其它組份及試劑對測定無干擾。結果表明，在該氨基酸分析儀的分析條件下，其他成分對復方α-酮酸片中的5種氨基酸成分的含量測定無干擾，表明所用方法的專屬性良好 。

圖1 復方α-酮酸片及氨基酸混標溶液的圖譜1.混合對照品溶液；B.供試品溶液；C.空白輔料

2.4 線性關系考察

取2.2中的混合對照品儲備液，分別精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的鹽酸溶液稀釋至刻度。按2.1的測定條件進行測定，記錄色譜圖峰面積，以峰面積(Y)對各組分的進樣量(X，mg·L-1)進行線性回歸，利用最小二乘法計算所得的回歸方程見表1。

表1 5種氨基酸的線性回歸方程統計

2.5 精密度考察

精密吸取2.2中的對照品溶液，按2.1的測定條件進行測定，連續進樣6次，記錄色譜圖，測得的各氨基酸的峰面積平均值和相對標準偏差見表2。表中數值顯示，6次測量的峰面積的精密度均在0.3% ～ 0.5%之間，符合《中國藥典》2020版關于方法精密度的要求。

表2 5種氨基酸混合對照品溶液的精密度測試結果(n=6)

2.6 重復性和重現性考察

取同一批號的復方α-酮酸片(批號81PA008)，按照2.2的方法，平行制備6份供試品溶液，分別按照2.1的測定條件進行測定。測得該批供試品中各氨基酸的結果如下：醋酸賴氨酸的平均含量為101.3%，RSD為1.2%；蘇氨酸的平均含量為99.8%，RSD為0.6%；色氨酸的平均含量為98.0%，RSD為1.6%；組氨酸的平均含量為102.9%，RSD為0.8%；酪氨酸的平均含量為98.0%，RSD為0.6%。請另一名試驗人員精密稱取同批次復方α-酮酸片，按照2.2的方法平行制備6份供試品溶液，按照2.1的測定條件進行測定，測得醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸的平均含量分別為：100.4%、99.6%、98.1%、102.6%、98.4%；RSD(n=6)分別為1.3%、0.5%、1.2%、0.6%、0.4%，均小于2.0%，重現性良好。

2.7 穩定性試驗

精密吸取同一批號(81PA008)的復方α-酮酸片，按照2.2的方法配制供試品溶液，分別于配制后 0、2、4、8、16、24 h 進行測定，測得醋酸賴氨酸、蘇氨酸、色氨酸、組氨酸、酪氨酸的平均峰面積分別為7923.094、6515.556、1375.456、3483.213、2279.894；RSD分別為0.6%、0.4%、0.8%、0.5%、0.2%。結果表明，供試品溶液在24 h內穩定。

2.8 回收率試驗

采用加樣回收試驗進行回收率測定，精密量取已知準確含量的同批供試品儲備液9份，每份各精密量取2 mL，每3份分別按“1.2∶1，1∶1，0.8∶1”的比例，精密加入適量的氨基酸對照品儲備溶液。計算回收率，結果見表3。利用該方法進行氨基酸測定時，復方α-酮酸片中5種氨基酸的平均回收率及RSD分別為：蘇氨酸平均回收率99.3%，RSD為1.4%；酪氨酸平均回收率102.9%，RSD為2.0%；組氨酸的平均回收率為98.2%，RSD為1.5%；色氨酸的平均回收率為101.9%，RSD為1.2%；醋酸賴氨酸的平均回收率為99.1%，RSD為1.0%。

表3 復方α-酮酸片中5種氨基酸的回收率試驗結果(n=9)

續表3

2.9 樣品的含量測定

取3批樣品，按2.2的方法制備供試品溶液和對照品溶液，按照2.1的方法進行測定，記錄色譜圖，以峰面積按外標法進行計算，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果(n=3)

3 討論

本研究建立了氨基酸分析儀法同時測定復方α-酮酸片中5種氨基酸的分析方法。該方法不再使用高劇毒的衍生化試劑、也不需要采用柱前衍生的自動進樣操作；操作簡單方便、效率高、成本低。

方法學試驗結果表明該方法對5種氨基酸能夠實現完全的基線分離，專屬性強、重復性好，且不受其他成分，如操作中帶入的碳水化合物等的干擾。結果準確可靠，精密度與線性關系均良好，可用于復方α-酮酸片的質量控制。