寵物食品中維生素B12的快速測定

韓 冀，石 磊，梁啟美，陶文靖，張君超，王玉花*

（1.通標標準技術服務（青島）有限公司，山東青島 266071；2.北京美正生物科技有限公司，北京 102200）

近年來，隨著經濟的發展，我國的寵物行業快速崛起，寵物食品的需求量也日益增加，近十年我國寵物食品的平均增長率為25%[1]。寵物食品指的是根據寵物的整個生理周期、寵物的品種和需要的營養而專門為寵物研發的營養均衡的食品[2]。目前，狗糧和貓糧是最具有經濟價值、規模和市場運作能力的主要寵物食品[3]。根據形態不同，可以將寵物食品分為干性寵物食品、濕性寵物食品和半干性寵物食品三大類[4]。我國寵物食品行業起步較晚，寵物營養管理方面的法規和標準并不完善。目前，行業內公認的三大營養標準包括美國飼料管理協會、美國國家研究委員會以及歐盟飼料行業協會的標準[5]。國內企業為滿足消費者的需要及出口需求，寵物食品中的營養成分會按照相應的美國飼料管理協會或歐盟飼料行業協會標準進行添加。

維生素B12（鈷胺素）是一種重要的維生素，在保持寵物健康方面發揮著一些特殊作用。維生素B12對于維持神經系統和細胞生長至關重要，同時在造血、改善大腦功能和維持良好的腸道健康方面也起著關鍵作用[6]。目前，對于維生素B12的檢測主要集中于功能飲料[7]、保健食品[8]、配方奶粉[9]和血清[10]等領域，對于寵物食品中的維生素B12的檢測鮮有報道。根據美國飼料管理協會的要求，犬糧中維生素B12的最低含量為2.8 μg/100 g，貓糧中維生素B12的最低含量為2.0 μg/100 g[5]。而歐盟飼料行業協會中規定，維生素B12在生長和繁育期犬糧和貓糧中的含量不得低于2.8 μg/100 g和1.8 μg/100 g，在成年期犬糧和貓糧中不得低于3.87 μg/100 g和2.35 μg/100 g。維生素B12的常用檢測方法包括HPLC法、HPLCMS法、酶聯免疫法和微生物法[11]，由于寵物食品的基質復雜且維生素B12的含量較低，微生物法是較為合適的選擇，該方法雖然靈敏度較高，但由于操作煩瑣，檢測周期長，重復性差而不能被廣泛應用。本研究擬對維生素B12的微生物測定法進行優化，將試管法改進為96孔微孔板法，對寵物食品中維生素B12的測定進行相關評價試驗，以期為寵物食品中維生素B12的檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

AL204-IC電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；LRH-250生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；VORTEX3渦旋振蕩器，德國IKA；HWS-28電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；DL-CJ-2ND潔凈工作臺，北京東聯哈爾儀器制造有限公司；ELX808酶標儀，美國BioTek；維生素B12檢測試劑盒，北京美正生物科技有限公司；萊士曼氏乳酸桿菌，美國典型菌種保藏中心，ATCC7830；維生素B12標準品，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH。

1.2 試驗用樣品的制備

選取9份不含有維生素B12的寵物食品樣品，包括3份全價貓糧基底、3份全價犬糧基底和3份成貓主食罐基底。人工添加維生素B12標準品至9批樣品中，使維生素B12含量分別為1.0 μg/100 g、5.0 μg/100 g 和 10.0 μg/100 g。

1.3 樣品的前處理

稱取1.0 g均質后的樣品，將其加入50 mL無菌離心管中，加入40 mL去離子水，在95 ℃水浴中提取30 min，每隔10 min混勻1次（確保離心管密封），然后快速冷卻至30 ℃以下。用0.22 μm無菌濾膜過濾取濾液。根據維生素B12的濃度范圍，在2 mL無菌離心管中使用無菌水對濾液進一步稀釋。

1.4 微孔板法檢測

1.4.1 配制維生素B12標準品

打開標準品瓶蓋，取2.8 mL無菌水加入標準品瓶中，蓋上瓶蓋，振蕩使標準品充分溶解，即為標準品工作液。取6個2 mL無菌離心管，將標準品工作液分別稀釋成 0 μg/100 g、0.03 μg/100 g、0.06 μg/100 g、0.09 μg/100 g、0.12 μg/100 g 和0.18 μg/100 g。

1.4.2 檢測菌液的制備

向維生素B12培養基瓶中加入10 mL無菌水，蓋緊瓶蓋，振蕩溶解。保證瓶蓋密閉的前提下，95 ℃水浴加熱5 min，然后快速冷卻至室溫（低于30 ℃）。使用0.22 μm無菌濾膜過濾全部培養基，用15 mL無菌離心管收集全部濾液。向凍干菌株瓶內加入1 mL無菌水，用移液槍吹打混勻，取其中的0.9 mL加入過濾后的培養基中，振蕩混勻，即為檢測菌液。

1.4.3 檢測步驟

取出所需數量的微孔條置于微孔架上，依次將140 μL標準品或樣品、140 μL檢測菌液加入微孔中，然后用粘膠薄膜蓋好微孔條，在37 ℃培養箱中避光孵育44～48 h。培養完成后，輕輕來回顛倒混勻微孔板，使菌液充分混勻，然后用一只手將微孔條固定于微孔架上，另一只手自右上方沿對角揭開粘膠薄膜，靜置2 min待氣泡全部消去后用酶標儀在610～630 nm下測量渾濁度，使用四參數法進行結果計算。

1.5 微生物法與微孔板法的比較

分別使用國家標準《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素B12的測定》（GB 5413.14—2010）與微孔板法對表1中所列9種寵物食品中的維生素B12進行測定，將這兩種方法的檢測結果進行比較研究，包括回收率分析及線性分析。

1.6 寵物食品樣品檢測

寵物食品分為濕糧和干糧兩大類，根據產品形態不同，干糧可分為高溫膨化糧、低溫烘焙糧、凍干糧和風干糧等，濕糧可分為罐頭和鮮食等。據此，選擇各品類共37個樣品，分別使用微孔板法與微生物法進行檢測，對檢測結果進行比較分析。

2 結果與分析

2.1 加標試驗回收率分析

分別使用微孔板法和微生物法對表1所列9份寵物食品樣品進行維生素B12的測定，計算各濃度水平的回收率，結果見表1。微生物法的回收率為94.0%～106.0%，而微孔板法的回收率稍低于微生物法，為93.0%～97.0%，回收率均能達到90%以上。

表1 寵物食品維生素B12加標回收率

2.2 自然樣品的檢測結果

選擇各品類共37個樣品，分別使用微孔板法與微生物法進行檢測，結果見表2。對兩種方法的結果進行顯著性差異分析，單因素方差分析結果顯示F＜Fcrit，表明在各品類寵物食品中，兩種方法的檢測結果符合率達100%，均無顯著性差異。

表2 兩種檢測方法的檢測結果

3 結論與討論

目前，微生物法是美國分析化學家協會和美國藥典檢測維生素B12的首選方法，但該方法操作煩瑣，影響結果的因素多，對測試人員的要求高。微孔板法的原理與微生物法基本一致，但極大程度上簡化了操作流程，減少了菌種在保存傳代中發生污染可能性，數據處理操作簡便。針對寵物食品特殊基質，進一步優化了提取流程，縮短檢驗周期，同時也減少了試驗過程中因操作步驟煩瑣引起的誤差，與微生物法相比，具備良好的穩定性與準確性。

寵物食品主糧產品分為干糧和濕糧兩類。干糧主要特征是水分含量少、表面干燥、顆粒狀，包括膨化糧、烘焙糧、風干糧和凍干糧等多種產品形態。濕糧主要是糊狀、水分含量高，主要有罐頭和鮮食兩種形態。徐坤等[12]研究發現，寵物食品在擠壓膨化、制粒及貯存過程中，各種維生素隨著溫度或時間的變化都有一定程度的損失。經擠壓加工后，寵物食品中脂類的氧化作用產生的氫過氧化物、過氧化物和環過氧化物等會引起維生素A、E等的氧化產生過氧化物，與活性的羰基反應造成維生素B6等的破壞，糖類非酶褐變產生的高度活化的羰基對維生素同樣具有破壞作用。王紅英等[13]以維生素C為例，對制粒過程中的調質溫度、蒸汽壓力、喂料器的給料速度等因素進行了試驗研究，提出了影響維生素穩定性的主要因素是調質溫度和蒸汽壓力。葛建東等[14]也發現在制粒時調質用的蒸汽、高溫以及擠壓所造成的摩擦都是破壞維生素的主要因素。膨化的調質溫度和壓力都高于制粒，破壞性更大，膨化時加入大量的水分也是一個重要影響因素。本研究測試了主要品類的貓糧及犬糧中的維生素B12，結果表明，維生素B12在凍干貓糧中的平均含量最高，達到16.0 μg/100 g，而在高溫膨化糧中的平均含量最低，僅為6.2 μg/100 g。需要說明的是，寵物罐頭及鮮食雖然維生素B12的平均含量更低，但由于其含水量高達70%～90%，因此折算干基后維生素B12含量更高。

隨著養寵滲透率的提升，并受益于寵物主對科學喂養理念的科普與產品認知的提高，越來越多的養寵人逐漸重視寵物的營養健康，國產寵物食品企業正在快速進階，相關部門也應當加大監管力度，并制定相關檢測標準和法規，促進我國寵物食品行業健康發展。