代謝參數指導補料速率提升糖化酶發酵水平

李迎凱，張健，胡江峰

（1.天津市經濟貿易學校，天津 300381；2.天津科技大學生物工程學院，天津 300457）

糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶，是一種外切酶，它可以將淀粉、糊精、糖原等物質轉化為葡萄糖[1]。糖化酶具有很重要的商業價值，已經在食品、醫學、釀造等領域得到了廣泛應用[2-5]。

糖化酶生產菌可以從細菌和酵母屬中分離得到[6-8]，但是目前工業上生產的糖化酶制劑大多來自曲霉和根霉[9-11]，其中黑曲霉（Aspergillus niger）被廣泛應用于糖化酶發酵生產[12-14]。黑曲霉在自然界中廣泛分布，作為一種非常重要的發酵工業菌種，可用于大規模的酶制劑工業化生產。黑曲霉在糖化酶大規模生產上優勢明顯，其變異小，穩定性高，副產物易去除[15-16]。隨著我國淀粉糖行業的快速發展，糖化酶的需求量與日俱增。另外，能源和生產原材料價格也在不斷增加，因此，提升該產業市場競爭力的關鍵就是提高糖化酶的生產能力，降低生產成本[17-18]。

糖化酶發酵過程主要是黑曲霉經深層通風發酵培養后菌體代謝產生。在菌體生長、代謝產物積累的過程中，發酵液中溶解氧都需控制在一定范圍內，達到產酶轉化率的最佳水平，以最低的能源消耗達到最大的產出，即高效生產。眾多研究報道顯示[19-23]，初始培養基的優化、不同發酵容器的優化、分批培養連續培養的應用，以及培養條件如含水率、溫度、pH值、溶氧、攪拌的優化等均可以較好地提高糖化酶的生產水平。但在工業生產過程中仍然面臨發酵后期酶活性增加緩慢、轉化率低的現象，尤其是發酵周期比較長的真菌發酵，在發酵后期菌絲體生長導致發酵液黏度增大一直是發酵行業普遍存在的問題[24-25]，生理代謝參數及相關性的分析已經成為進一步優化生產控制工藝、提升發酵水平的關鍵[26-27]，其中二氧化碳釋放速率（carbon evolution rate，CER）表示細胞代謝過程中CO2的釋放速率，它的水平能夠有效地反映細胞生理代謝狀態，因此可以作為衡量發酵水平的重要指標[28]。

本研究通過糖化酶發酵過程生理代謝參數的采集系統，利用多參數相關分析，考察了不同補料方式與生理代謝參數的變化，并結合CER進行補料量的相關優化試驗，以期提高糖化酶產量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

糖化酶生產用菌為黑曲霉（Aspergillus niger）：天津市經濟貿易學校實驗室保藏。

1.1.2 培養基

種子培養基：玉米淀粉90 g/L，玉米漿12 g/L，豆餅粉8 g/L。

發酵培養基：玉米淀粉200 g/L，玉米粉50 g/L，豆餅粉 12g/L，玉米漿 18g/L，KH2PO410g/L，（NH4）2SO42 g/L，CaCl20.3 g/L，檸檬酸 0.5 g/L，硫酸鉀 5 g/L。

補料培養基：一水葡萄糖500 g/L。

1.2 儀器與設備

FUS-50L（A）攪拌式生物反應器：國強生化裝備有限公司；InPro3100i pH值電極、InPro6860i溶氧電極：梅特勒-托利多儀器有限公司；MAX300-LG過程尾氣質譜儀：美國艾科特里爾公司。

1.3 方法

1.3.1 檢測方法

1.3.1.1 糖化酶酶活性的測定

酶活性使用淀粉葡萄糖苷酶（amyloglucosidase，AGI）表示。1個AGI單位定義為在pH值4.3和溫度60℃條件下，每1 min從可溶性淀粉水解生成1 μmol葡萄糖所需的酶的質量。50 mg糖化酶標品對應大約2 500 AGI。糖化酶酶活性測量：230 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷試劑（37℃預熱5 min）與20 μL發酵上清液混合，37℃反應20 min后加入100 μL p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷試劑，在405nm下測量混合液體吸光度來定量糖化酶。

1.3.1.2 菌體濃度（packed mycelium volume，PMV）的測定

取發酵液10 mL于離心管中，4 000 r/min離心10 min后，沉淀物占10 mL發酵液的體積百分比即為菌體濃度。

1.3.1.3 溶氧（dissolved oxygen，DO）的測定

通過溶氧電極在線監測溶氧情況。

1.3.1.4 CER的測定

通過過程尾氣質譜儀在線監測。

1.3.2 發酵方法

種子培養：在無菌條件下，將斜面上的孢子用去離子水洗下，接入5 L發酵罐中，裝液量為3 L，培養溫度32℃，攪拌轉速240 r/min，罐壓0.05 MPa，發酵時間48 h，待pH值出現反彈10 h后移種于50 L發酵罐。

分批培養：將制備好的種子培養液在無菌條件下按接種量10%轉入50 L發酵罐中，初始發酵體積為25 L，培養溫度維持在34℃，攪拌轉速為180 r/min，罐壓0.1 MPa，發酵過程中通過流加氨水控制pH值為4.7，連續補料發酵180 h。發酵過程中在線監測DO和CER，每隔6 h分別取樣檢測PMV及酶活性。

1.3.3 停止補料與降低補料對發酵后期產酶的影響

分別按照以下補料方式進行發酵。補料方式1：正常連續補料發酵180 h；補料方式2：在發酵120 h時停止補料，10 h后恢復補料量為130 mL/h發酵至180 h；補料方式3：在發酵120 h時降低補料量到30 mL/h，持續20 h后恢復補料量為130 mL/h發酵至180 h；補料方式4：在發酵120 h時降低補料量到30 mL/h，持續10 h后恢復補料量為130 mL/h發酵至180 h。

1.3.4 結合CER的變化趨勢停止與恢復補料對發酵后期產酶的影響

在正常連續補料發酵過程中監測CER變化趨勢，當CER開始出現下降趨勢并持續36 h后停止補料，直至CER上升為峰值時恢復補料量為130 mL/h發酵至180 h。為保證試驗結果的穩定，進行3次發酵。

2 結果與分析

2.1 停止補料與降低補料對發酵后期產酶的影響

不同補料方式下DO、CER、PMV及酶活性變化如圖1所示。

圖1 不同補料方式的DO、CER、PMV及酶活性變化曲線Fig.1 DO，CER，PMV and enzyme activity curves of different dosing mode

由圖1a可以看出補料方式2發酵168 h后DO開始反彈，而其他補料方式DO并未出現反彈。由圖1b可以看出，除了補料方式1，其余補料方式的CER均在發酵至138 h時出現反彈，其中，補料方式2發酵后期的CER值明顯高于其他補料方式。由圖1c可知，對比PMV變化，補料方式2發酵后期PMV略低于其他補料方式。由圖1d可以看到補料方式2、3、4酶活性在發酵后期均高于補料方式1，其中補料方式2的酶活性明顯高于其他補料方式，且酶活性一直呈上升趨勢。

綜合以上結果，補料方式2在發酵后期DO、CER出現反彈，且酶活性高，說明停止補料有利于菌絲發生斷裂，使發酵液黏度下降，從而增加了發酵罐內氧傳遞速率，菌體代謝活力上升，有助于酶活性的增加。補料方式2的最終酶活性比正常發酵增加了40%。

2.2 結合CER的變化趨勢停止與恢復補料對發酵后期產酶的影響

將3次發酵的DO、CER、PMV及酶活性變化與補料方式2進行對比，結果見圖2。

圖2 補料方式2與結合CER恢復補料的DO、CER、PMV及酶活性變化曲線Fig.2 DO，CER，PMV and enzyme activity curves by dosing mode 2 and resuming dosing based on CER

由圖2a可知，3次發酵試驗DO在發酵132 h后都出現反彈，反彈幅度均高于補料方式2。圖2b說明停止補料與結合CER恢復補料的CER都會出現反彈。由圖2c可知，在發酵156 h后3次發酵試驗的PMV均低于補料方式2。3次發酵的酶活性均一直呈上升趨勢（圖2d），且發酵后期酶活性明顯高于補料方式2。

綜合以上結果，對比補料方式2，結合CER來進行補料的停止與恢復，在發酵后期DO出現更加明顯的反彈，且PMV也明顯降低，酶活性更高，說明CER下降一段時間后停止補料可以使菌體將培養基中的碳源得到進一步消耗，這樣迫使菌體處于饑餓狀態，從而菌絲體的斷裂更加充分，發酵液黏度下降，溶氧開始上升。當在CER反彈到峰值時再恢復補料，可以使菌體將恢復的碳源流向產酶代謝途徑，有助于酶活性的增加。3次試驗最終酶活性平均值達到20 895 AGI/mL，比補料方式2增加了18%。

3 結論

將菌體生理代謝參數CER與補料方式相結合成功應用于黑曲霉糖化酶的發酵優化過程，結果表明，在發酵中后期CER下降36 h時停止補料，一直到CER反彈到峰值恢復補料，能夠使菌體斷裂更加充分，從而提升了菌體的氧消耗速率，促進糖化酶在發酵后期依然保持較高的合成速率，3次發酵最終糖化酶的平均酶活性達到20 895 AGI/mL，對比優化之前的正常連續補料提高了60%。

改變補料方式只是優化的開始，在發酵前期補料量以及發酵后期如何根據溶氧水平增加補料量等諸多方面優化還需要進一步試驗驗證。本文結合CER進行補料方式優化取得較好的效果，對結合生理代謝參數優化糖化酶以及其他工業酶類的發酵水平具有借鑒意義，并對生產過程也具有指導作用。