核桃分心木提取物的抗氧化活性及其對油脂氧化穩(wěn)定性的影響

肖敏，趙鑫丹，郝苑汝，陳凱，翟梅枝，2*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省核桃工程技術(shù)研究中心，陜西 楊凌 712100）

核桃分心木（Diaphragma juglandis Fructus，DJF），又稱核桃隔膜，是胡桃科核桃屬植物核桃（Juglans regia L.）果核內(nèi)的木質(zhì)隔膜[1]。分心木顏色呈棕色或淺棕褐色，約占核桃總質(zhì)量的4%～5%，體輕且易折斷，味道苦澀、食性平和，具有健脾固腎、利尿清熱等功效[2]。但分心木是核桃生產(chǎn)的副產(chǎn)品，一直被視為廢棄物未得到綜合利用。研究表明，核桃分心木富含多種生物活性成分，包括黃酮、有機(jī)酸、酚類、生物堿、油脂、皂苷、揮發(fā)油、氨基酸、鞣質(zhì)、糖類、多肽及其他微量化合物[3]。分心木中的次生代謝物質(zhì)具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、降糖和抗炎等多種生物活性作用。MENG等[4]從核桃分心木中提取的多糖具有良好的抑菌活性，且抑菌活性隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)。趙煥新等[5]對分心木中分離獲得的單體化合物進(jìn)行抗氧化活性研究，發(fā)現(xiàn)沒食子酸、兒茶素、槲皮素等8種化合物均顯示不同程度的DPPH自由基清除能力，清除能力較強(qiáng)的3種化合物分別為沒食子酸（IC50=2.10 mg/L）、槲皮素（IC50=3.81 mg/L）和二氫槲皮素（IC50=4.82 mg/L）。李平[6]對核桃分心木水提取物進(jìn)行抗腫瘤試驗，得出水提物濃度在50 μg/mL～400 μg/mL時對人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制效果顯著。MENG等[7]對核桃分心木多糖DJP-2進(jìn)行體外和體內(nèi)降血糖測定，體外試驗中，DJP-2對α-淀粉酶和α-D-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值分別為1.129 mg/mL和0.588 mg/mL；體內(nèi)實(shí)驗中，添加50 mg/kg DJP-2的小鼠血糖明顯下降。王丹[8]通過脂多糖 （lipopolysaccharide，LPS） 誘導(dǎo)小鼠巨噬 細(xì)胞RAW264.7建立炎癥反應(yīng)模型，對核桃分心木中分離得到的單體化合物進(jìn)行抑制細(xì)胞炎癥因子一氧化氮（NO）表達(dá)，結(jié)果顯示，沒食子酸、槲皮素、胡桃醌等對于炎癥模型NO表達(dá)具有顯著的抑制作用。綜上，核桃分心木具有多種生物活性，且其具有顯著的抗氧化活性。

油脂是人們膳食中最重要的營養(yǎng)成分和能量的來源之一[9]。油脂易氧化，其自動氧化嚴(yán)重影響油脂的食用品質(zhì)，且危及人體健康。為防止油脂自動氧化多采用添加抗氧化劑的方法，而目前食品工業(yè)中常用的合成抗氧化劑如特丁基對苯二酚（tert-butyl hydroquinone，TBHQ）、二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）等已被證明具有一定致癌性[10]，因此，從天然產(chǎn)物中尋找和開發(fā)天然無毒的抗氧化劑至關(guān)重要。徐蓓蓓[11]研究核桃不同部位提取的多酚物質(zhì)對核桃油酸值的影響，結(jié)果表明TBHQ抗氧化效果最好，核桃青皮多酚效果比TBHQ略差。陳向明等[12]研究山核桃果殼提取物對菜籽油的油脂穩(wěn)定性，結(jié)果表明不同添加量的山核桃果殼水浸液對菜籽油均有抗氧化活性，且隨著水浸提液濃度的增加，抗氧化能力逐漸增強(qiáng)。

近年來核桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，隨著產(chǎn)量的增加副產(chǎn)品也逐年增加，因此，綜合開發(fā)利用核桃副產(chǎn)品提高其附加值，已成為延長核桃產(chǎn)業(yè)鏈的重要途徑。本文在核桃分心木乙醇提取濃度篩選及不同極性溶劑萃取物抗氧化活性研究的基礎(chǔ)上，探討添加不同濃度的最佳活性萃取物對菜籽油氧化穩(wěn)定性的影響，以期為核桃分心木作為天然抗氧化劑資源進(jìn)行深度開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃：采自西北農(nóng)林科技大學(xué)核桃種質(zhì)資源圃。挑選大小基本一致且無病蟲害的果實(shí)，人工去青皮、去殼，獲得分心木，粉碎，過60目篩，裝瓶備用。食用菜籽油：市售。

2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸[2，2'-azino-bis （3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：北京索萊寶科技有限公司；沒食子酸（標(biāo)準(zhǔn)品）：張家界奧術(shù)科技有限公司；蘆丁（標(biāo)準(zhǔn)品）、維生素C：上海源葉生物科技有限公司；福林酚（生物試劑）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2，4，6-三（2-吡啶基）三嗪[2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：成都市科隆化學(xué)品有限公司。以上試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)控超聲波清洗器（KH-DE）：昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1200）：上海美譜達(dá)儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（RE-52AA）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 核桃分心木乙醇溶液提取物及不同極性溶劑萃取物制備

不同濃度乙醇溶液提取物制備：以不同濃度（20%、40%、60%、80%、無水乙醇）乙醇溶液提取抗氧化活性成分，料液比 1∶30（g/mL），53 ℃超聲輔助提取55 min，9 000 r/min離心10 min，收集上清液，殘渣重復(fù)提取兩次，合并上清液，減壓濃縮得到相應(yīng)濃度乙醇溶液提取物。

不同極性溶劑萃取物制備：將得到的乙醇溶液提取物用少量蒸餾水溶解，依次用1.5倍體積的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇分別萃取至萃取液基本無色，合并萃取液，減壓濃縮得石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和萃余物。

1.3.2 DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基清除率測定試驗

分別采用趙鑫丹等[13]、陸彩瑞[14]以及黃尚榮等[15]的DPPH自由基、ABTS+自由基和羥基自由基清除試驗方法，用VC做陽性對照，自由基清除能力以IC50值表示。

1.3.3 總酚和總黃酮含量測定

總酚含量測定：參考趙鑫丹等[13]的方法測定樣品總酚含量。以0.01 mg/mL～0.06 mg/mL沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=10.974x+0.017 1，R2=0.999 0。

總黃酮含量測定：參考趙鑫丹等[13]的方法測定樣品總黃酮含量。以0.1 mg/mL～1.0 mg/mL蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為y=0.755 6x+0.017 1，R2=0.998 6。

1.3.4 高活性萃取物對菜籽油氧化穩(wěn)定性測定

參照賀娜等[16]和南海娟等[17]的油脂氧化試驗方法，采用Schaal烘箱法，稍加修改。將不同濃度正丁醇萃取物按0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%的添加量分別加入菜籽油中，以0.02%的VC和TBHQ作為對照，混合均勻后所有油樣置于溫度為（70±1）℃的烘箱中加速氧化，每隔24 h測定其過氧化值和酸值。酸值測定方法參考GB 5009.229—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中酸價的測定》；過氧化值測定方法參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中過氧化值的測定》。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用IBM SPSS Statistics 25.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇提取濃度的篩選

不同濃度乙醇溶液的提取物DPPH自由基清除率見圖1，IC50值、總酚及總黃酮含量的結(jié)果見表1。

圖1 不同濃度乙醇溶液提取物對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of ethanol solution extracts on the scavenging rate of DPPH free radical

表1 不同濃度乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除能力的IC50值及總酚、總黃酮測含量Table 1 IC50 of DPPH free radical scavenging ability and total phenol and total flavonoids content of alcohol extracts at different concentrations

由圖1可見，核桃分心木乙醇溶液提取物對DPPH自由基的清除率隨溶液濃度升高而增強(qiáng)。60%乙醇溶液提取物和無水乙醇提取物的DPPH自由基清除率在濃度為0.015 mg/mL時，分別為81.42%和77.42%；在濃度為0.030 mg/mL時，清除率分別為92.36%和92.61%。當(dāng)濃度為0.015 mg/mL時，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除率是80%乙醇溶液提取物的1.47倍，無水乙醇提取物DPPH自由基清除率是80%乙醇溶液提取物的1.40倍。當(dāng)濃度為0.030 mg/mL時，60%乙醇溶液提取物和無水乙醇提取物DPPH自由基清除率均是80%乙醇溶液提取物的1.1倍。

由表1可見，不同濃度乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除能力強(qiáng)弱為60%乙醇溶液提取物＞無水乙醇提取物＞20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物，與許多研究者得出的結(jié)果相似，如馮淦熠等[18]采用60%、70%、80%的乙醇溶液提取桑葉多酚，結(jié)果顯示60%乙醇溶液提取物的DPPH自由基清除率顯著高于其他濃度的乙醇溶液提取物。王靜等[19]比較不同濃度乙醇溶液提取物對羥基自由基、DPPH自由基以及ABTS+自由基的清除能力，結(jié)果表明，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除率最高。總酚含量大小依次為20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞60%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物＞無水乙醇提取物。其中20%乙醇溶液提取物總酚含量最高，為358.921 mg沒食子酸/g；無水乙醇提取物總酚含量最低，為213.058 mg沒食子酸/g。不同濃度乙醇溶液提取物的總黃酮含量存在差異，含量大小依次為60%乙醇溶液提取物＞無水乙醇提取物＞20%乙醇溶液提取物＞80%乙醇溶液提取物＞40%乙醇溶液提取物。其中60%乙醇溶液提取物總黃酮含量最高，達(dá)到了736.748 mg蘆丁/g；40%乙醇溶液提取物總黃酮含量最低，為389.026 mg蘆丁/g。本研究結(jié)果表明，60%乙醇溶液提取物DPPH自由基清除效果最好，且總黃酮含量最高。綜合考慮認(rèn)為60%乙醇溶液為核桃分心木抗氧化活性物質(zhì)提取的適宜溶劑，且提取物中總黃酮含量的高低可以作為提取物抗氧化活性篩選的重要指標(biāo)。

2.2 核桃分心木乙醇溶液提取物不同極性萃取物的抗氧化活性

2.2.1 不同極性溶劑萃取物得率及抗氧化活性

使用不同極性有機(jī)溶劑對60%乙醇溶液提取物進(jìn)行萃取。不同萃取物的萃取得率、DPPH自由基清除能力及總酚、總黃酮含量見表2。

表2 不同萃取物萃取得率和DPPH自由基清除能力的IC50值及總酚、總黃酮含量測定Table 2 Extraction rate of different extracts，IC50 of DPPH free radical scavenging ability and determination of total phenols and total flavonoids

由表2可見，就核桃分心木乙醇溶液提取物不同溶劑的萃取得率來看，大小順序依次為正丁醇萃取物＞萃余物＞乙酸乙酯萃取物＞石油醚萃取物。正丁醇萃取物得率最高，為47.360%，石油醚萃取物得率最低，僅為5.882%，正丁醇萃取物得率為石油醚萃取物得率的8倍左右。就DPPH自由基清除能力而言，正丁醇萃取物的DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，其IC50值為0.010 mg/mL，乙酸乙酯萃取物次之，IC50值為0.011mg/mL，兩者接近；石油醚萃取物的清除能力最弱，IC50值為1.070 mg/mL。就總酚和總黃酮含量而言，正丁醇萃取物的均為最高。各萃取物的DPPH自由基清除能力及總酚、總黃酮的含量大小順序均為正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>萃余物>石油醚萃取物。這與甄兆孟等[20]、邵瑾等[21]研究結(jié)果一致。綜合分析顯示，核桃分心木乙醇溶液提取物的正丁醇萃取物中總酚及總黃酮含量最高，且DPPH自由基清除能力最好，故選擇正丁醇萃取物進(jìn)行核桃分心木抗氧化活性研究。

2.2.2 高活性萃取物的抗氧化活性

不同濃度正丁醇萃取物對DPPH自由基、ABTS+自由基以及羥基自由基的清除能力由其IC50值表示，VC為對照，結(jié)果如表3所示。

表3 正丁醇萃取物的抗氧化能力的IC50值Table 3 IC50 values for the antioxidant capacity of n-butanol extracts mg/mL

由表3可見，正丁醇萃取物可有效清除DPPH自由基，IC50值為0.010 mg/mL。高潔[22]對核桃隔膜抗氧化能力的研究結(jié)果顯示，隔膜中的黃酮對DPPH自由基的清除能力接近VC，本研究結(jié)果與其有一定差距，這可能是正丁醇萃取物中物質(zhì)種類多，多種物質(zhì)共存對黃酮類物質(zhì)的抗氧化能力產(chǎn)生了一定的拮抗作用。正丁醇萃取物對ABTS+自由基也有較強(qiáng)的清除能力，其IC50值為0.010 mg/mL，但對羥基自由基的清除能力較弱，IC50值為1.226 mg/mL。結(jié)合表2分析，核桃分心木乙醇溶液提取物的正丁醇萃取物中總酚和總黃酮含量高，可以有效清除DPPH自由基和ABTS+自由基。

2.2.3 高活性萃取物對菜籽油氧化穩(wěn)定性的影響

以不同濃度的正丁醇萃取物處理菜籽油，以VC、TBHQ作為對照，測定油脂酸值與過氧化值，結(jié)果見圖2。

圖2 不同濃度正丁醇萃取物、VC和TBHQ的酸值和過氧化值測定Fig.2 Determination of acid value and peroxide value of n-butanol extract，VCand TBHQ with different concentrations

由圖2可見，隨著時間的延長，各處理的菜籽油酸值和過氧化值逐漸增大。第7天各處理對油脂酸值和過氧化值的抑制作用順序均為0.02%TBHQ>0.05%正丁醇萃取物>0.04%正丁醇萃取物>0.03%正丁醇萃取物>0.02%VC>0.02%正丁醇萃取物>0.01%正丁醇萃取物>CK。圖2a顯示，隨著正丁醇萃取物添加量的增加，對菜籽油酸敗的抑制作用增強(qiáng)。在對照CK中，第7天酸值（4.66 mg/g）是第1天酸值（1.44 mg/g）的3.24倍；添加0.01%正丁醇萃取物的油脂第7天酸值（4.02 mg/g）是第1天酸值（1.27 mg/g）的3.17倍；而添加0.05%正丁醇萃取物的油脂第7天酸值（3.14 mg/g）是第1天酸值（1.39 mg/g）的2.26倍。對于已知的食品抗氧化劑VC和TBHQ，添加0.02%VC的油脂第7天酸值（3.62 mg/g）是第1天酸值（1.38 mg/g）的2.62倍，添加0.02%TBHQ的油脂第7天酸值（3.06 mg/g）是第1天酸值（1.32 mg/g）的2.32倍，與添加0.05%正丁醇萃取物的油脂酸值（acid value，AV）變化差異不大。從達(dá)到油脂酸敗國標(biāo)臨界值（AV≤3 mg/g）的時間來看，處理第5天，對照CK酸值（3.31 mg/g）已超過臨界值，而其他處理組均未超過臨界值；處理第6天時，添加0.02%VC處理組的酸值已超過3 mg/g，達(dá)到3.49 mg/g，但添加0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂酸值分別為2.89 mg/g和2.45 mg/g，均未超過臨界值，說明添加0.05%正丁醇萃取物抑制油脂酸敗的效果優(yōu)于添加0.02%VC，但與添加0.02%TBHQ相近。在第6天～第7天添加0.05%正丁醇萃取物的油樣酸值達(dá)到臨界值，第7天酸值超過臨界值，為3.14 mg/g。由此認(rèn)為添加一定濃度的核桃分心木正丁醇萃取物可有效抑制食用油脂酸敗，且在0.01%～0.05%內(nèi)樣品添加濃度越高，油樣酸價達(dá)到臨界值所需要的時間越長。

由圖2b可知，正丁醇萃取物對菜籽油的油脂過氧化有一定的抑制效果，且隨著添加濃度的增大抑制效果增強(qiáng)。從過氧化值（peroxide value，POV）達(dá)到國標(biāo)臨界值（POV≤6 mmol/kg）的時間來看，在處理第5天，對照CK過氧化值（6.946 mmol/kg）已超過臨界值，而其他處理組均未超過臨界值；添加0.03%、0.04%、0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂，在處理第6天POV均未超過臨界值，POV依次為 5.898、5.465、5.012、2.228 mmol/kg，但添加 0.02%VC的 POV 已超過6 mmol/kg，達(dá)到6.567 mmol/kg。添加0.05%正丁醇萃取物和0.02%TBHQ的油脂，第7天時POV未超過國標(biāo)臨界值，POV分別為5.913 mmol/kg和2.369 mmol/kg。這也說明添加0.05%正丁醇萃取物可有效抑制菜籽油的氧化作用。因此，以核桃分心木為原料開發(fā)天然抗氧化劑，不僅可綜合利用核桃副產(chǎn)品資源，還可提高核桃的附加值，利用前景廣闊。

3 結(jié)論

在不同供試濃度的乙醇溶液中，60%乙醇溶液為核桃分心木抗氧化活性物質(zhì)的最適宜提取溶液。核桃分心木抗氧化活性物質(zhì)富集相為乙醇溶液提取物的正丁醇萃取相，該萃取物具有較好的體外抗氧化活性，對ABTS+自由基的清除能力最強(qiáng)。正丁醇萃取物具有抑制菜籽油酸敗和氧化作用。添加0.05%正丁醇萃取物第6天的抑制效果優(yōu)于添加0.02%VC，與添加0.02%TBHQ相近；第7天其抑制菜籽油的氧化效果與添加0.02%TBHQ的相近，過氧化值未超過國標(biāo)臨界值。綜上認(rèn)為，核桃分心木乙醇溶液提取物具有較好的抗氧化活性，作為天然抗氧化劑來源在食用油脂抗氧化中具有廣闊應(yīng)用前景。