嗜酸乳桿菌復合益生菌片對小鼠免疫功能的影響及機制研究

朱自平，汪振炯，朱華

（1.廊坊市農林科學院，河北 廊坊 065000；2.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；3．江蘇第二師范學院生命科學與化學化工學院江蘇省生物功能分子重點建設實驗室，江蘇 南京 211200）

益生菌是能夠通過調節腸道菌群的平衡來維持宿主消化系統和腸道健康的一類活的微生物的總稱[1-2]。益生菌不僅可以維持宿主腸道微生物穩態和屏障功能，還能調節腸黏膜的免疫功能，可有效地提高腸道干擾素水平以及吞噬細胞和自然殺傷細胞的活性，已被證實是一種良好的免疫激活劑。益生元是指一些不被宿主消化吸收卻能被宿主體內的菌群選擇性利用并轉化為有益于宿主健康的物質[3]。常用的益生元為低聚糖類，包括低聚果糖、低聚半乳糖、低聚木糖、低聚異麥芽糖、大豆低聚糖、菊粉等。合生元又稱合生素或共生元，是益生菌和益生元的混合制劑[4]。其中，益生元作為益生菌的營養和能量來源，可協同促進益生菌在腸道的定植和功效發揮。基于合生元的多樣性功能，研究已經證實了其免疫保護增強的作用[5]，合生元增強吞噬細胞等的功效，已廣泛應用于人類和動物保健與疾病預防治療過程[6-9]。其中，有報道表明熱滅活乳雙歧桿菌BL-99能夠增強免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）的分泌，促使小腸黏膜上的淋巴細胞的分化及增殖[10]，并激活自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）和巨噬細胞（macrophage），生成白介素1（interleukin1，IL-1）、白介素 6（interleukin 6，IL-6）、白介素 12（interleukin 12，IL-12）、ɑ 腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ）及干擾素（interferon，IFN）等細胞因子，激活腸黏膜免疫系統，調節機體的免疫應答，進而增強機體免疫力[11]。Finamore等[12]研究發現，乳桿菌與長雙歧桿菌的復合益生菌能夠通過影響初始T細胞、記憶T細胞，B細胞、調劑性T細胞和NK細胞，提高人體的免疫力，其中，兩株益生菌的混合物并沒有改變NK細胞的總數，但增加了NK細胞的活性，從而改善了先天性免疫。翟云等[13]研究發現，乳雙歧桿菌M8可以提高免疫抑制模型大鼠的淋巴細胞百分比、T淋巴細胞轉化增殖能力和提高血清IgA、免疫球蛋白G（immunoglobulins G，Ig G）、白介素 2（interleukin 2，IL-2）、IL-6、Ⅱ型干擾素（IFN-γ）及 TNF-ɑ 水平，從而改善細胞免疫、體液免疫及固有免疫應答調控，增強模型大鼠的免疫功能。乳桿菌能在進入機體后激活腸黏膜免疫系統，起到保護機體免受感染源的侵襲、抗突變和防癌、預防糖尿病和心血管疾病的作用[14-16]。

本文使用嗜酸乳桿菌LA85和低聚果糖復配組成合生元菌劑（復合益生菌片），并飼喂健康小鼠，通過監控小鼠的體重、免疫器官指數（脾臟指數和胸腺指數）、細胞免疫（淋巴細胞增殖）、體液免疫[半數溶血值（half value of hemolysin，HC50）]、巨噬細胞吞噬能力和 NK 細胞活性等指標[17-19]，以確定嗜酸乳桿菌復合益生菌片對小鼠免疫能力的影響，為進一步開發、應用嗜酸乳桿菌合生元提供一定的理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

嗜酸乳桿菌LA85：微康益生菌（蘇州）股份有限公司；低聚果糖：量子高科（中國）生物股份有限公司；生理鹽水、漢克氏液（pH7.2）、RPMI1640培養液、小牛血清、青鏈霉素、刀豆蛋白 A（concanavalin A，ConA）、瓊脂糖、噻唑藍（thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT）、磷酸鹽緩沖液、補體（豚鼠血清）、文齊氏試劑、1%NP-40裂解液、吉姆薩染液：北京索萊寶科技有限公司；SA緩沖液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲基酯硫酸鹽、氧化型輔酶I：上海源葉生物科技有限公司；Tris-HCl、Na2CO3、冰醋酸、鹽酸、異丙醇（均為分析純）：國藥化學上海有限公司；綿羊紅細胞（sheep red blood cell，SRBC）、雞紅細胞：南京森貝伽生物技術有限公司；小鼠淋巴瘤細胞YAC-1：上海一研生物科技有限公司。

1.2 實驗動物

健康SPF級ICR小鼠[雌性，共240只，動物許可證號SCXK（京）2016-0011]：北京維通利華實驗動物技術有限公司。

1.3 主要儀器

電子天平（BSA 124S型）：德國賽多利斯公司；超凈工作臺（SW-CJ-2D）：蘇州凈化設備公司；細胞培養箱[BPN-150CRH（UV）]：上海一恒科學儀器有限公司；全波段酶標儀（Epoch型）：美國BioTek公司；臺式高速低溫冷凍離心機（TGL16M）：上海赫田科學儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 復合益生菌片制備

向經過冷凍干燥的嗜酸乳桿菌LA85菌粉中，添加一定量低聚果糖及其他食品級輔料（玉米淀粉、麥芽糊精等），混合，利用淀粉糖漿為黏合劑，濕法制粒壓片法得到該復合益生菌片，1 g/片，每片含嗜酸乳桿菌LA85 1.0×106CFU和低聚果糖0.25 g，4℃保存。

1.4.2 實驗動物處理和分組

將240只小鼠隨機分為4組，每組60只，分別開展遲發型變態反應（delayed type hypersensitivity，DTH）、臟器/體重比值、半數溶血值測定和抗體生成細胞檢測實驗（實驗Ⅰ組）、巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力實驗（實驗Ⅱ組）和ConA誘導小鼠淋巴細胞轉化和NK細胞活性測定實驗（實驗Ⅲ組）。各實驗組低、中、高劑量設為人體推薦食用量的5倍、10倍、30倍，每組中的60只小鼠隨機分為4小組，每小組15只，以0.167 g/kg bw（低劑量組）、0.333 g/kg bw（中劑量組）、1.000 g/kg bw（高劑量組）的劑量分別灌胃小鼠，同時設生理鹽水為陰性對照組。各劑量組及陰性對照組均按20 mL/kg bw給予灌胃（以生理鹽水稀釋后灌胃），每周根據小鼠體重增長情況調整灌胃量，30 d后，分別測定相關免疫功能指標。

1.4.3 臟器/體重比值測定

小鼠稱重，采血處死，取脾臟、胸腺等器官，稱重，計算脾臟/體重比值和胸腺/體重比值。

1.4.4 遲發型變態反應

采用足趾增厚法評估遲發型變態反應（DTH）的程度。具體方法：小鼠給予復合益生菌片30 d，第25天，每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數）壓積SRBC懸液，致敏后4 d，測量小鼠左后足趾厚度。隨后每只小鼠在測量部位皮下注射20 μL 20%SRBC，注射后24 h測量左后足趾厚度，同一部位測量3次取平均值，以注射前后足趾厚度的差值（足趾腫脹度）來表示DTH程度。

1.4.5 ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗（MTT法）

飼喂復合益生菌片30 d后處死小鼠，無菌取脾制備單細胞懸液，調整細胞濃度到2×107個/mL，按MTT法，在570 nm處測定OD值，利用加ConA實驗孔的OD值和不加ConA實驗孔的OD值之差評估小鼠的淋巴細胞增殖能力。

1.4.6 抗體生成細胞檢測實驗（改良玻片法）

小鼠給予復合益生菌片30 d，第25天每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數）壓積SRBC進行免疫，4 d后無菌取全脾制成單細胞懸液，以每管0.5 mL分裝小試管，向管內再加50 μL 10%SRBC（用SA緩沖液配制，體積分數）和脾細胞懸液20 μL，迅速混勻，傾倒至已刷瓊脂糖薄層的玻片上，制平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入CO2培養箱中繼續孵育1.5 h，然后將用SA緩沖液稀釋的補體（1∶8，體積比）放入玻片架凹槽內，繼續孵育2.0 h，計數溶血空斑數。

1.4.7 血清溶血素溶血值的測定

小鼠給予復合益生菌片30 d，第25天每只小鼠腹腔注射0.2 mL 2%（用生理鹽水配制，體積分數）壓積SRBC進行免疫，4 d后摘除眼球取血，靜置1 h以充分析出血清，隨后離心收集血清。用SA緩沖液稀釋300倍，依次取血清稀釋液0.1 mL，10%（體積分數）SRBC 0.05 mL，補體0.1 mL，混勻后37℃保溫30 min后置于冰浴終止反應，離心，取上清液0.05mL加文齊氏試劑0.15 mL，混勻放置10 min后用酶標儀在540 nm處測定OD樣品，空白樣品為取0.0125 mL 10%（用SA緩沖液配制，體積分數）壓積SRBC，加文齊氏試劑至0.2 mL充分混勻，放置10 min之后測定540 nm處ODSRBC，半數溶血值HC50按下式計算。

1.4.8 腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗

小鼠給予復合益生菌片30 d后，每只腹腔注射5%壓積雞紅細胞懸液1 mL。2.5 h后處死小鼠，腹腔注入2 mL生理鹽水洗滌，取腹腔液制滴片，移至37℃恒溫箱孵育30 min。孵育結束后用生理鹽水漂洗，固定細胞，染色，鏡檢計數100個巨噬細胞，吞噬率和吞噬指數按下式計算。

1.4.9 NK細胞活性測定（乳酸脫氫酶測定法）

實驗小鼠喂食復合益生菌片30 d后，處死小鼠，無菌取其脾臟，制成脾細胞懸液作為效應細胞，裂解紅細胞并進一步調整細胞濃度為2×107個/mL。按效靶比為50∶1，將YAC-1細胞（靶細胞）和脾細胞（效應細胞）各100 μL加入U型96孔培養板，靶細胞自然釋放孔加靶細胞和含10%胎牛血清的RPMI1640完全培養液各100 μL，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100 μL，上述均設3個平行孔，37℃，5%CO2環境下培養4 h。隨后，離心5 min，各孔吸取100 μL上清液置于平底96孔板，隨后加入100 μL乳酸脫氫酶基質液置于暗處反應10 min后加入30 μL 1 mol//L的HCl溶液終止反應，在492 nm處利用酶標儀讀取OD值，并進一步按以下公式計算NK細胞活性。

1.5 數據處理

所有實驗數據用平均值±標準差（X±SD）表示，采用DPS7.05軟件對各組實驗數據進行單因素方差分析，P＜0.05作為顯著性標準。

2 結果與討論

2.1 復合益生菌片對小鼠體重的影響

飼喂復合益生菌片期間，小鼠活動正常，生長發育良好，未觀察到異常體征或死亡。表1～表3為各實驗組小鼠體重變化。

表1 實驗Ⅰ組小鼠的體重變化Table 1 The weight changes of mice in experimental group I

表2 實驗Ⅱ組小鼠的體重變化Table 2 The weight changes of mice in experimental group Ⅱ

表3 實驗Ⅲ組小鼠的體重變化Table 3 The weight changes of mice in experimental group Ⅲ

由表1～表3可知，飼喂復合益生菌片30 d后，各實驗組小鼠體重增長正常，各劑量組與對照組之間無顯著性差異（P>0.05），可以初步得出長期口服該復合益生菌片對動物生長安全性良好。

2.2 復合益生菌片對小鼠臟器/體重比值的影響

小鼠的胸腺及脾臟的絕對臟器比值如表4所示。

表4 復合益生菌片對小鼠臟器/體重比值的影響Table 4 Effect of probiotic compound tablets on the ratio of organ and body weigh in the mice

飼喂復合益生菌片30 d后，其脾臟/體重比值和胸腺/體重比值與對照組間相比無明顯差異（P>0.05）。

2.3 復合益生菌片對小鼠細胞免疫功能的影響

復合益生菌片對各組小鼠遲發型變態反應（DTH）的影響見圖1。

圖1 復合益生菌片對小鼠遲發型變態反應（DTH）的影響Fig.1 Effect of probiotic compound tablets on delayed-type hypersensitivity（DTH）in the mice

由圖1可知，與陰性對照組比較，經口給予小鼠不同劑量的復合益生菌片30 d，在低、中、高劑量組的小鼠足趾腫脹度均極顯著提高（P<0.01），表明該復合益生菌片可影響小鼠DTH。

復合益生菌片對各組小鼠淋巴細胞增殖的影響見表5。

表5 復合益生菌片對淋巴細胞增殖的影響Table 5 Effect of probiotic compound tablets on lymphocyte proliferation

由表5可知，經統計學分析，與陰性對照組相比，經口給予小鼠不同劑量的復合益生菌片30 d后，其淋巴細胞增殖能力在中、高劑量組顯著增強（P<0.05），表明該復合益生菌片能在中高劑量水平上有效促進由ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖。T淋巴細胞和B淋巴細胞的增殖是機體細胞免疫的直接反饋，可以判定細胞免疫功能陽性[20]。

2.4 復合益生菌片對體液免疫的影響

復合益生菌片對抗體生成細胞數和小鼠半數溶血值的影響見圖2。

圖2 復合益生菌片對抗體生成細胞數和小鼠半數溶血值的影響Fig.2 Effect of probiotic compound tablets on antibody-producing cells and half hemolysin value in mice

由圖2a可知，喂食30 d后，中、低劑量復合益生菌片均可極顯著提高小鼠抗體細胞生成數（P<0.01）。進一步由圖2b可知，喂食低劑量和中劑量復合益生菌片可極顯著提高小鼠半數溶血值（HC50）（P<0.01），而喂食高劑量復合益生菌片可顯著提高HC50值（P<0.05）。因此可以證明復合益生菌片可有效改善小鼠體液免疫功能。

2.5 復合益生菌片對小鼠單核-巨噬細胞吞噬功能的影響

飼喂復合益生菌片對實驗小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響見表6。

表6 復合益生菌片對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響Table 6 Effect of probiotic compound tablets on mice peritoneal macrophages phagocytosis of chicken red blood cells

由表6可知，與陰性對照組相比，中、高劑量組復合益生菌片對吞噬雞紅細胞能力有顯著性差異，且高劑量組的吞噬率和吞噬指數較陰性對照組有極顯著提高（P<0.01），表明飼喂復合益生菌片有助于提高機體的非特異性免疫功能。

2.6 復合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響

飼喂復合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響見圖3。

圖3 復合益生菌片對小鼠NK細胞活性的影響Fig.3 Effect of probiotic compound tablets on the activity of NK in mice

由圖3可知，經口給予小鼠不同劑量的復合益生菌片30 d后發現，各處理劑量的復合益生菌片均可極顯著提高NK細胞的活性（P<0.01）。結合其對小鼠巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的實驗結果可知飼喂復合益生菌片可有效提高單核-巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性，從而提高機體的非特異性免疫功能。

3 結論

飼喂以嗜酸乳桿菌LA85和低聚果糖等復配壓片所制得的復合益生菌片對小鼠體重增長無影響。喂食各劑量組復合益生菌均可顯著提高小鼠足趾腫脹度（DTH）（P<0.01）；在中、高劑量水平上有效促進小鼠淋巴細胞增殖（P<0.05），低、中劑量水平上可極顯著提高小鼠抗體生成細胞數（P<0.01）和 HC50值（P<0.01），高劑量水平則可提高HC50值（P<0.05），證明可有效改善小鼠細胞免疫能力和體液免疫能力。此外，飼喂復合益生菌片可有效提高單核-巨噬細胞吞噬功能和NK細胞活性，因此，該復合益生菌片對小鼠細胞免疫、體液免疫、非特異免疫功能均具有一定的增強作用，證明飼喂復合益生菌片有助于全面調動機體免疫系統，阻止外來物質的侵入，從而增強機體免疫力。綜上所述，嗜酸乳桿菌LA85復合益生菌片具備較好地增強小鼠機體免疫的能力，且安全性良好，應用前景廣闊。