豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測方法的建立及應(yīng)用

朱海俠 陳 雷 傅星源 潘小慧 李梟辰 饒云萍

（兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014）

豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine，Mps）又稱豬氣喘病，是由豬肺炎支原體（Mycoplasmal hyopneumoniae，Mhp）引起的一種慢性呼吸道疾病。雖然該病死亡率低，但發(fā)病率高，世界各地均有流行[1]。豬群感染該病后會引起機械性咳嗽，日增重下降，飼料報酬率降低等。嚴重時，當呼吸道黏膜纖毛屏障受到破壞后，很容易繼發(fā)感染其它病原菌，導(dǎo)致豬只死亡。在當前非洲豬瘟疫情形勢嚴峻的大環(huán)境影響下，豬價急速上漲，如何在保證豬群不受非洲豬瘟侵襲的情況下迅速育肥、出欄，成為養(yǎng)豬業(yè)密切關(guān)注的問題。

目前對豬支原體肺炎的預(yù)防主要有藥物和疫苗預(yù)防兩種措施。但在當前國家法規(guī)“禁抗”的背景下，疫苗免疫成為防控該病的關(guān)鍵。研究表明[2]，疫苗免疫在減輕因該病造成的肺部病變、提高日增重和飼料轉(zhuǎn)化率方面效果明顯，且對控制同群豬只感染、降低母豬帶菌率等非常重要。當前針對豬支原體肺炎的疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活苗兩種，但滅活苗主要以體液免疫為主，即使添加相關(guān)佐劑的滅活疫苗也只能產(chǎn)生有限的細胞免疫[3]，豬支原體肺炎滅活疫苗不能阻止野毒的感染。此外，對豬肺炎支原體而言，滅活疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體水平和阻止病原移行及疾病的發(fā)生聯(lián)系不大，只能作為一種參考性指標[4]。豬支原體肺炎滅活疫苗免疫后由于不能阻止豬肺炎支原體野毒對支氣管纖毛的定植，因此，無法產(chǎn)生完全的保護。而免疫豬支原體肺炎活疫苗后，能夠有效地激活全身的細胞免疫和局部黏膜免疫[5]。作為黏膜免疫系統(tǒng)的效應(yīng)分子，分泌型IgA 在呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道的黏膜抗感染中發(fā)揮重要作用[6]。特異性IgA 的水平已經(jīng)作為大多數(shù)研究中評估疫苗使用效果和早期疾病發(fā)生的主要依據(jù)。

P97 蛋白是發(fā)現(xiàn)最早的Mhp 黏附蛋白，也是最重要的一種毒力因子。它包含R1 和R2 兩個重復(fù)區(qū)域，其中R1 區(qū)是主要的抗原決定簇[7]。在Mhp 感染早期，血清和黏膜中均能檢測到針對P97R1 區(qū)的特異性抗體，并已確定為豬肺炎支原體早期感染的血清學標志物[8]。抗豬支原體肺炎IgA 是Mhp 感染或免疫后在呼吸道首先產(chǎn)生的特異性標志，同時也反映了疫苗免疫后的保護效果[9]。本研究采用豬肺炎支原體P97R1 蛋白作為包被用抗原，通過建立豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 檢測方法，結(jié)合現(xiàn)有的血清學、病原學檢測方法，以期更好地用于評估免疫豬群Mhp 疫苗使用效果以及未免疫豬群的自然感染情況。

1 材料與方法

1.1 菌種、血清、陰陽性肺泡灌洗液 豬肺炎支原體（168 株）活疫苗由本公司提供；PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、TGEV 陽性血清由本實驗室保存；Mhp豬陰陽性肺泡灌洗液的制備參照文獻[9]。

1.2 主要試劑 PET-32a 原核表達載體由本實驗室保存；2×Taq PCR Master Mix 購自天根生化科技（北京）有限公司；PrimeStar Max polymerase、EcoRⅠ、HindⅢ限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；大腸桿菌DH5α，transetta(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購自Megan；蛋白凝膠試劑盒購自博士德生物工程有限公司；His 融合蛋白純化柱（5 mL 預(yù)裝柱）購自上海七海復(fù)泰生物技術(shù)有限公司；TMB 顯色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；BSA 購自Bioshrap；羊抗豬IgA-HRP購自BethlyⅠ。

1.3 引物設(shè)計與合成 參照文獻[10]，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

1.4 Mhp P97R1 基因的擴增 以豬肺炎支原體（168 株）菌株為模板，用所合成的引物進行P97R1基因擴增。反應(yīng)體系：PrimeSTAR Max premix（2×）25 uL，上下游引物（20 um/mL）各1 uL，DNA 1 uL，補足ddH2O 至50 uL。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃延伸5 s，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1.0%核酸凝膠電泳檢測。

1.5 PET32a-P97R1 重組基因表達載體的構(gòu)建利用DNA 凝膠試劑盒對P97R1 基因擴增產(chǎn)物進行純化，利用ECORⅠ和HidⅢ限制性內(nèi)切酶對P97R1基因片段和PET-32a 載體進行雙酶切，利用T4DNA連接酶對雙酶切產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化，并對菌落進行鑒定和序列測定，將鑒定為陽性的菌落進行質(zhì)粒提取。

1.6 P97 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、純化及鑒定 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化transetta（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取單菌落，利用IPTG 誘導(dǎo)劑進行誘導(dǎo)表達，離心收集菌體，收集的上清和菌體進行SDS-PAGE 鑒定，經(jīng)Western Blot 鑒定正確的菌株經(jīng)處理后用His 融合蛋白純化柱進行純化。

1.7 豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 檢測方法的建立及應(yīng)用

1.7.1 P97R1 蛋白最佳包被濃度及最佳陰陽性肺泡灌洗液稀釋濃度的確定 采用方陣滴定法，將P97R1 重組蛋白用碳酸鹽緩沖液（CBS，pH9.6）按照8 ug/mL、4 ug/mL、2 ug/mL、1 ug/mL、0.8 ug/mL、0.5 ug/mL、0.4 ug/mL 比例進行稀釋后，包被96 孔ELISA 酶標板，100 uL/孔，同時設(shè)置空白對照，4 ℃包被過夜。PBST 洗滌3 次，拍干，加入一定量BSA于37 ℃作用一段時間；洗滌，拍干，將陰陽性肺泡灌洗液按1∶10、1∶20、1∶25、1∶30、1∶40、1∶50 的稀釋倍數(shù)進行稀釋、加樣，100 uL/孔，37 ℃孵育一段時間后，洗滌、拍干，加入一定濃度的羊抗豬IgA-HRP，37 ℃孵育一段時間；洗滌，拍干，加入TMB 顯色，室溫作用10 min；加入2 M H2SO4終止反應(yīng)，測定OD450nm值，以P/N 比值最大的抗原包被濃度和樣品稀釋度為最佳的工作濃度。

1.7.2 最佳包被條件的確定 采用最佳的抗原包被濃度及陰陽性樣品稀釋倍數(shù)，將酶標板包被抗原后分別置于4 ℃過夜，37 ℃、1 h，37 ℃、2 h，其它條件不變，以P/N 比值最大的包被條件確定為最佳包被條件。

1.7.3 最佳封閉濃度及封閉時間的確定 采用最佳的抗原包被濃度及陰陽性樣品稀釋濃度，將酶標板分別用5%BSA、4%BSA、3%BSA、2%BSA、1%BSA 進行封閉，其它條件不變，以P/N 比值最大的封閉濃度確定為最佳封閉濃度，并根據(jù)最佳封閉濃度確定最優(yōu)的封閉時間。

1.7.4 最佳一抗工作時間的確定 采用最佳的包被條件，將陰陽性樣品進行一定濃度稀釋后，置37 ℃分別作用30 min、45 min、60 min，其它條件不變，以P/N 比值最大的作用時間確定為最佳一抗工作時間。

1.7.5 羊抗豬IgA-HRP 最佳工作條件的確定 采用最佳的包被條件，將羊抗豬IgA-HRP 按照一定稀釋比例（說明書推薦濃度）稀釋后分別在37 ℃作用30 min、45 min、60 min，其它條件不變，以P/N 比值最大的作用時間確定為最佳二抗工作濃度和工作時間。

1.8 臨界值的確定 用上述建立的方法檢測52 份臨床鼻拭子樣本（陰性組），測定OD450nm值。根據(jù)統(tǒng)計學原理，OD450nm≥X+3SD 時，判定為陽性；OD450nm≤X+2SD 時，判定為陰性；介于兩者之間的判定為可疑[11]，同時利用medcalc 軟件分析ROC 曲線，最終確定其臨界值。

1.9 特異性試驗 按照建立的方法，分別對PRRSV、PCV2、CSFV、PRV、PEDV 陽性血清樣品進行檢測，根據(jù)OD450nm值，確定上述建立方法的特異性。

1.10 敏感性試驗 采用上述建立的間接ELISA 方法對不同稀釋倍數(shù)的MPs IgA 陽性抗體進行檢測，確定該檢測方法的靈敏度。

1.11 Mhp 抗體ELISA 檢測方法的應(yīng)用 為了解某豬群豬肺炎支原體感染情況，選取已知試驗場采集豬群鼻拭子，并通過臨床疫苗實際免疫情況，結(jié)合Mhp PCR 檢測方法對豬群Mps 感染情況進行分析，比較該抗體檢測方法與豬群實際情況的符合率情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 P97R1 基因的擴增 以Mhp 168 菌株為模板，采用特異性引物對P97R1 基因進行PCR 擴增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示擴增出大小為280 bp 的目的片段，與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1）。

圖1 P97R1 基因的PCR 擴增

2.2 PET32a-P97R1 原核表達載體的構(gòu)建 將PET32a 載體與P97R1 基因進行連接，轉(zhuǎn)化后，利用PET32a 通用引物對獲取的菌落進行PCR 鑒定及測序分析。結(jié)果表明：獲取預(yù)期結(jié)果已知的目的條帶，測序結(jié)果符合預(yù)期（見圖2）。

圖2 P97R1 重組基因陽性菌落的鑒定

2.3 重組P97R1 蛋白的誘導(dǎo)表達、鑒定及純化 將重組質(zhì)粒PET32a-P97R1 轉(zhuǎn)化至transetta（DE3）中，挑取單菌落，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)4 h 后獲得了可溶性表達蛋白，其大小約為35 kDa（見圖3）。使用His 融合蛋白陽性血清作為一抗，經(jīng)Western Blot 驗證其為His標簽融合蛋白。經(jīng)His 標簽融合蛋白純化柱進行純化，獲取較高純度的蛋白，蛋白濃度為336 ug/mL。

圖3 P97R1 重組蛋白誘導(dǎo)表達分析

2.4 豬支原體肺炎IgA 抗體間接ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化 通過方陣滴定試驗，確定其最優(yōu)反應(yīng)條件（見表1）。

表1 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.5 臨界值確定 52 份Mps 陰性豬鼻拭子OD450nm的平均值為0.204，標準差（SD）為0.081，確定：當樣品OD450nm值≥0.446 判定為陽性；當樣品OD450nm值≤0.365 判定為陰性；當0.365＜樣品OD450nm＜0.446 判定為可疑。ROC 曲線結(jié)果顯示，在OD450nm≤0.365 時具有較好的特異性和靈敏度。

2.6 特異性試驗 結(jié)果表明，本研究建立的間接ELISA 方法與上述病原均無交叉反應(yīng)，具有良好的特異性（見表2）。

表2 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測方法特異性檢測

2.7 敏感性試驗 應(yīng)用上述建立的檢測方法對不同稀釋倍數(shù)的Mhp 陽性肺泡灌洗液進行檢測，結(jié)果顯示當樣品稀釋至1∶35 時，OD450nm值為0.47，判定為陽性（見表3）。

表3 豬支原體肺炎IgA 抗體ELISA 檢測方法靈敏度檢測

2.8 Mhp 抗體ELISA 檢測方法的應(yīng)用 應(yīng)用上述建立的方法對某試驗場豬群的92 份鼻拭子樣品進行測定，結(jié)果共計檢出陰性樣品73 份，陽性樣品13 份，可疑樣品6 份。對陽性樣品、可疑樣品及部分陰性樣品進行Mhp 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陽性樣品的鼻拭子中均存在Mhp 抗原，可疑和陰性樣品中無Mhp檢出。

3 討論

黏膜免疫是豬支原體肺炎活疫苗的免疫機制之一。P97R1 是Mhp 纖毛結(jié)合素P97 蛋白氨基酸序列C 末端的重復(fù)序列，直接參與Mhp 對豬呼吸道黏膜上皮纖毛粘附并發(fā)揮粘附功能，具有很強的免疫原性[12]。華利忠等[13]指出，無論是肺內(nèi)免疫還是氣溶膠免疫豬支原體肺炎活疫苗均能在一定時間內(nèi)短暫誘導(dǎo)免疫豬上呼吸道的黏膜免疫，為免疫豬提供早期保護。SIgA 作為黏膜免疫的主要指標，也是病原體入侵機體后最先產(chǎn)生的抗體。疫苗免疫后通過快速占位機制能夠有效地阻止豬肺炎支原體野毒的入侵。有報道指出，支原體僅需1 h 就能大量粘附宿主細胞，免疫后2 h 就能夠在肺泡灌洗液中檢測到毒株的存在。本研究發(fā)現(xiàn)豬支原體肺炎IgA 抗體陽性豬只鼻拭子中Mhp 檢測基本為陽性，陰性豬鼻拭子樣品中均未檢測到Mhp 的存在，且免疫后豬鼻拭子中Mhp 存在時間達42 d 之久。這一結(jié)果再次驗證了豬支原體肺炎活疫苗（168 株）免疫后能夠長時間在呼吸道黏膜產(chǎn)生很好的占位效應(yīng)，且能夠刺激機體產(chǎn)生很好的黏膜免疫反應(yīng)。針對豬支原體肺炎抗體的檢測方法，很多學者做了相關(guān)的研究[14]。逯曉敏等[9]建立了抗豬支原體肺炎IgA 間接ELISA 檢測方法，并將全菌和P97R1 蛋白分別作為抗原進行對比分析，指出全菌蛋白雖然包含了病原菌的全部抗原蛋白，但其可能會與呼吸道其它支原體產(chǎn)生非特應(yīng)性交叉反應(yīng)。本研究方法與該方法相比大大縮短了檢驗時間，降低了檢驗過程的復(fù)雜性。

當前市面上存在的豬肺炎支原體試劑盒主要是針對血清中IgG 抗體的診斷試劑盒。而血清中IgG抗體水平的高低與動物的免疫保護情況并無相關(guān)性。且研究表明[5]，豬群免疫豬支原體肺炎活疫苗能夠產(chǎn)生細胞免疫，并不能激活機體體液免疫應(yīng)答；自然感染和免疫滅活苗的豬群則能夠激活機體的體液免疫應(yīng)答。本研究發(fā)現(xiàn)，免疫Mhp 活疫苗的豬群血清中無抗體產(chǎn)生，在鼻拭子中能夠檢測到IgA 的存在，且經(jīng)過PCR 鑒定有Mhp 的存在，隨著時間的推移，豬肺炎支原體含量逐漸降低。這些結(jié)果與先前學者報道的一致[12]。當前對于豬支原體肺炎抗體的檢測并沒有一個標準作為參照，大多依據(jù)豬群的免疫情況、臨床癥狀以及剖檢后肺部評分來確定豬群感染豬肺炎支原體的情況。在當前豬病“老病不斷，舊病新發(fā)”且多種疾病共感染的情況下，根據(jù)上述依據(jù)已很難對Mhp 疫苗的使用效果作出有效評定。

本研究通過Mhp IgA 抗體檢測方法的建立，結(jié)合Mhp 抗原檢測以及市面上豬支原體肺炎血清抗體檢測，能夠有效區(qū)分豬群Mhp 自然感染或疫苗免疫的情況，更有利于對豬群Mhp 免疫情況進行評估，為豬支原體肺炎疫苗的使用效果提供很好的評估方案。