熒光抗體病毒中和方法檢測豬瘟抗體

包松英 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）可引起豬群出現高熱、出血等癥狀的烈性傳染病[1]，免疫接種豬瘟疫苗是防治CSFV 感染最經濟的手段之一。20 世紀50 年代，我國學者通過在兔體內傳代350 多代致弱獲得安全性好、免疫原性優秀的疫苗種毒C 株，70 多年來，C 株疫苗為我國豬瘟防控起到了至關重要的作用。C 株疫苗陽性血清可對11 種豬瘟野毒和石門強毒株產生中和效力，因此，在現階段CSF 流行趨勢下，其依然是防控豬瘟的良好選擇[2]。

目前，臨床對于豬瘟疫苗免疫效果的評價方法主要是抗體檢測。豬瘟抗體檢測方法包括間接免疫熒光試驗、間接血凝試驗、兔體中和試驗、熒光抗體病毒中和試驗（Fluorescent antibody virus neutralization test，FVNT）、酶聯免疫吸附試驗（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等，其中ELISA 是目前應用最廣的抗體檢測手段[3]，具備簡便易操作的優點，但常用的間接ELISA 或阻斷ELISA 方法所用的單抗主要針對E2 蛋白，通常在豬群免疫2～4 周左右才可檢測出較高抗體陽性率[4]，不能很好地反映疫苗早期的免疫效果；間接血凝試驗檢測血清中豬瘟全病毒抗體，操作簡便、易于臨床推廣，但與同病毒屬的其它病毒存在交叉反應、致敏紅細胞批間差異較大等缺點；兔體中和試驗是檢測豬瘟抗體的經典方法，但存在試驗兔個體差異、檢測成本高、耗時長等問題[5]；FVNT 為國際貿易指定的豬瘟抗體檢測方法，采用固定病毒中和稀釋的血清，以熒光抗體檢測方法檢測豬瘟抗體。本試驗在FVNT 方法的基礎上進行改進，采用對豬瘟病毒更敏感的ST 細胞檢測豬群免疫豬瘟活疫苗（兔源）后的抗體水平，為更客觀地評價疫苗免疫早期的抗體水平提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 病毒、血清和細胞 豬瘟病毒：Thiveral 株，購自中國獸藥監察所，批號：SF2-20160717。豬瘟活疫苗（兔源）：由兆豐華生物科技（福州）有限公司生產，批號2017070。待檢血清：選擇福州市永泰縣某試驗豬場豬瘟抗原抗體陰性的4 周齡小豬15 頭，其中13 頭免疫豬瘟活疫苗（兔源），另外2 頭作為陰性對照，免疫生理鹽水，分別于一免后7 d、13 d、24 d、34 d 及二免后10 d、20 d 無菌采血，獲得90 份待檢血清，檢測前經過56 ℃水浴30 min 滅活。細胞：ST細胞，購自中國獸藥監察所，由兆豐華生物科技（福州）有限公司保存傳代。

1.2 試劑 MEM 培養基、胎牛血清均購自Gibco 公司；豬瘟病毒間接免疫熒光檢測試劑盒，購自中國獸藥監察所。

1.3 病毒培養 將豬瘟病毒（Thiveral 株）按培養液的1%接種ST 細胞單層，37 ℃孵育1 h 后，加入含1%～5%無牛病毒性腹瀉(BVD)抗體且無豬瘟抗體的胎牛血清MEM 培養液，培養48～60 h，收獲病毒液，分裝凍存于-15 ℃以下冰箱。

1.4 間接免疫熒光法測豬瘟病毒效價

1）將1.3 步驟中收獲的豬瘟病毒（Thiveral 株）作10 倍系列稀釋，取10-3、10-4、10-5、10-6四個稀釋度接種于96 孔板培養的ST 細胞單層，每個稀釋度接6 孔，100 μL/孔，設立空白對照2 孔，僅加MEM培養液，置CO2培養箱于37 ℃孵育1 h，加入含1%～5%胎牛血清的MEM 培養液，100 μL/孔，培養96 h后待檢。

2）棄去待檢細胞的細胞液，以PBS 輕柔洗滌1～2 次后加入80%冷丙酮溶液，100 μL/孔，2～8 ℃固定30 min，之后棄去丙酮，自然晾干。

3）PBS 洗滌1～2 次，每孔加洗液200 μL，室溫孵育3～5 min 后棄去PBS。

4）加入豬瘟病毒特異性抗體50 μL，37 ℃濕盒作用1 h 后，棄去一抗，重復1.4 步驟3）。

5）加入FITC-兔抗豬IgG（二抗）50 μL/孔，37 ℃濕盒作用1 h 后棄去二抗，重復1.4 步驟3）。

6）用藍色激發光（選擇波長490 nm 光源）在倒置顯微鏡下放大100～200 倍進行觀察。

7）如待檢細胞孔出現特異性胞漿內黃綠色熒光，判為陽性，否則判為陰性，并按Reed-Munch 法計算，判讀熒光組培半數感染量（TCID50）。

1.5 熒光抗體病毒中和方法檢測豬瘟抗體效價

1）利用熒光抗體病毒中和方法原理，采用固定病毒稀釋血清的方法檢測豬瘟抗體。首先將待檢血清用MEM 做2 倍系列稀釋，接著將豬瘟病毒（Thiveral 株）稀釋成含200TCID50/0.1 mL 的工作抗原，將待檢血清與工作抗原等體積混勻，成為病毒與血清混懸液，37 ℃孵育1 h，以MEM 培養液作為陰性對照，以工作抗原為陽性對照，與被檢樣品在同樣條件下處理。

2）將上一步驟的混懸液接種96 孔板培養的ST細胞單層，每孔100 μL，每個稀釋度6 孔，孵育1 h。

3）棄去混懸液，補充含3%～5%血清的MEM 培養液，每孔200 μL，培養3～5 d。

4）余下步驟參照豬瘟病毒間接免疫熒光檢測試劑盒使用方法操作。

5）當陽性對照孔出現而陰性對照孔未出現特異性黃綠色熒光時，試驗結果成立，否則，試驗結果不成立。如待檢細胞孔出現特異性胞漿內黃綠色熒光，判為陰性，否則判 為陽性，以Reed-Muench 法計算血清的中和抗體 滴度。

1.6 數據分析 采用SPSS 17.0 軟件進行單因素方差分析，以LSD 法進行兩兩比較。

2 結果

陽性對照孔可見黃綠色熒光，陰性對照孔無熒光，試驗結果成立。試驗豬免疫前中和抗體均小于1∶2。本次試驗共使用試驗豬15 頭，其中免疫組13 頭，空白對照組2 頭，采集免疫后6 個時間點豬前腔靜脈血液樣品，進行熒光抗體病毒中和試驗，結果見表1。

表1 間接免疫熒光法檢測中和抗體結果

6 個時間點的抗體陽性率均為100%，13 頭豬在一免7 d 即可檢測到中和抗體，之后抗體水平快速升高，一免34 d，中和抗體水平均值達1∶33.9；二免后10 d，中和抗體水平略有降低，之后繼續升高，二免20 d，中和抗體水平均值達1∶38.85，高于一免24 d 的1∶26.16（見圖1）。

圖1 6 個時間點中和抗體平均值消長趨勢

利用SPSS 17.0 對免疫后6 個采樣時間點的檢測數據進行單因素方差分析，結果見表2。一免7 d相對于之后所有采樣時間點，中和抗體水平均差異顯著（P＜0.05）；二免后中和抗體水平略有下降，之后快速上升，二免20 d 相較于一免13 d，抗體水平差異極顯著（P＜0.01）。

表2 6 個時間點Bonferroni 分析結果

3 討論

豬瘟兔化弱毒C 株疫苗長期以來被應用于我國豬瘟防控，其在組織器官中的增殖不引起病理損傷和病毒血癥[6]，免疫豬體5 d 后即可抵御豬瘟強毒攻擊[7]。豬瘟活疫苗（兔源）是C 株接種健康家兔，收獲出現定型熱的兔體脾臟和腸系膜淋巴結研磨制備而成的疫苗，保留了病毒良好免疫原性，且副反應小[8]，徐磊[9]發現，豬瘟兔化弱毒脾淋苗可刺激豬體產生比細胞苗更高比例的CD3+和CD4+淋巴細胞亞群、CD4+/CD8+比值、淋巴細胞以及高水平的IFN-γ 和IL-3。而本試驗結果表明，在一免7 d，所有免疫組小豬血液中均已檢測到具有中和活性的熒光抗體，說明豬瘟活疫苗（兔源）可在短時間內刺激豬體產生體液免疫應答。規模豬場一般對仔豬進行2 次豬瘟疫苗免疫，以保證良好的免疫保護效果[10]。本試驗在二免10 d 檢測到抗體，水平相對于一免34 d 略有下降，之后快速上升，二免后20 d 的中和抗體水平極顯著高于一免后13 d（P＜0.01），說明二次免疫，可顯著提升豬瘟抗體水平。

目前，豬瘟抗體檢測方法包括間接免疫熒光試驗、間接血凝試驗、兔體中和試驗、FVNT 法、ELISA法等。其中IDEXX 公司的豬瘟抗體阻斷ELISA 檢測試劑盒在科研與臨床上被廣泛使用，該試劑盒檢測的抗體與中和抗體具有較好的相關性，但在中和抗體滴度為8 時，阻斷率為（36±2）%，中和抗體滴度＜8 時，則檢測結果均為陰性[11]。由此可見，在疫苗免疫早期，宜采用中和試驗檢測豬瘟抗體，若采用商品化ELISA 檢測試劑盒，檢測結果多為陰性或可疑。采用本試驗方法，檢測結果準確且更敏感，適合獸用生物制品企業進行豬瘟疫苗免疫早期的抗體監測。本試驗結果為臨床評估豬瘟疫苗免疫效果提供了數據參考，后期擬進一步開展不同抗體檢測方法的相關性試驗。