調控動物生殖功能的lncRNAs研究進展

李海玲,方富貴

(安徽農業大學 動物科技學院，安徽 合肥 230036)

LncRNA是一類轉錄本長度超過200 nt的RNA分子，既往被認為是RNA聚合酶Ⅱ轉錄的副產物，不具有生物學功能[1]。然而，近年來的研究已經發現了大量的lncRNA參與調控動物的生長發育過程，其中包括細胞分化與凋亡過程、激素水平、器官發育、X染色體失活以及對基因組印記的調控[2]。但迄今為止，只有一小部分lncRNAs的功能與作用機制被闡明。如定量蛋白質組學分析揭示了lncRNA-Ftx通過上調MGC80-3細胞HK2促進胃癌的進展[3]；通過直接調控miR-27a/Smurf1軸，Xist的下調可在體內外減輕SCI模型的凋亡和炎癥損傷[4]；lncRNA LEGLTBC作為競爭性內源性RNA發揮作用，調節miR-34a/ sirt1介導的糖毒性INS-1細胞的氧化應激和凋亡[5]。

目前已發現多種lncRNAs與動物生殖功能息息相關。如一些lncRNAs與胚胎干細胞、精原干細胞等增殖分化和自我更新過程關系密切，還參與胚胎發育、卵子發生等過程，并在抑制乳腺癌、卵巢癌等生殖腫瘤過程中發揮重要作用[6]。因此，深入研究生殖系統中lncRNAs功能和機制將豐富我們對生殖系統發育、功能及其疾病的認識，同時也為相關藥物的研發提供新視角。本文主要綜述了已發現的與動物生殖功能相關的lncRNAs及其作用機制，并對lncRNAs調控生殖的未來研究進行展望，有助于理解lncRNA在動物生殖調控中的功能與機制。

1 調控雄性動物生殖的lncRNAs

在人、大鼠和小鼠特定發育階段的睪丸中已經鑒定出許多lncRNAs，其中一些lncRNAs的功能已經被注釋和表征，例如睪丸特異性X連鎖基因(Testis specific x-linked，Tsx)，減數重組熱點基因(Meiotic recombination hot spot locus，Mrhl)和差異性甲基化區域(Differentially methylated region，Dmr)等，它們在睪丸發育和精子發生過程中發揮著重要的作用[2]。

1.1 Tsx

Tsx曾被認為是一個位于染色體失活中心的蛋白質編碼基因，但隨后被證明是一個lncRNAs，它的轉錄本在減數分裂中的生殖細胞、胚胎干細胞和腦組織中過表達[7]。小鼠和人類的X染色體失活需要存在一個cis作用位點，即X染色體失活中心(X-inactivation center，Xic)。這個位點控制X-染色體失活(X-chromosome inactivation，XCI)，并富含產生lncRNA的基因。在XCI過程中，上游位點Xite需要維持Tsx在未來活性X上的表達。Tsx位于Xite的正上游，其進化前體為脊椎動物的Fip112基因，由于其獨特的位置和進化歷史，因此頗受關注[8]。

人和小鼠Tsx基因具有顯著的同源性，特別是在外顯子1、3、4、5和6中[9]。研究發現，Tsx突變雄性小鼠的睪丸體積明顯比野生型小，TUNEL分析顯示隨著動物第一次進行減數分裂，生殖細胞丟失，表明Tsx參與了雄性生殖細胞的發育；與此同時，Tsx在粗線期精母細胞中特異性表達，暗示其在生殖細胞減數分裂中具有一定的調控作用[7]。與在睪丸支持細胞和小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)中的表達量相比，Tsx在粗線期精母細胞中表達量最高；同時TUNEL染色和突觸復合蛋白1(synaptonemal complex protein 1, SCP1)免疫熒光結合發現，小鼠Tsx基因敲除后，粗線期細胞的一個子集不適當地發生凋亡，敲除Tsx不影響減數分裂的XCI過程，提示Tsx在精子細胞中還有其他功能[10]。這些研究表明Tsx在精母細胞減數分裂進程中至關重要，但其具體作用機制還不清楚。

1.2 Mrhl

Mrhl全長2.4 kb，它是從位于8.26號染色體減數分裂重組熱點位點(mrhl)的Phkb基因的第14個內含子轉錄而來的，是一個多聚腺苷和未剪接的RNA轉錄本，表達于肝臟、腎臟、脾臟和睪丸[11]。Kataruka等[12]研究小組繪制了Mrhl RNA 的染色質占用圖，并表明Mrhl調節幾種基因的表達，其中許多基因在精子發生以及Wnt信號傳導中起關鍵作用，其中的基因之一是Sox8，MrhlRNA與Sox8啟動子的結合伴隨著其他調控因子的裝配，包括Myc-Max-Mad轉錄因子、輔抑制因子Sin3a和輔激活因子Pcaf。在Wnt信號中，Sox8直接調控減數分裂前期和減數分裂標志物的表達。精原細胞中Wnt信號的延長激活導致了整體染色質結構的改變和干細胞標志物水平的降低。2008年，Ganesan等研究發現Mrhl通過兩種分子機制調控精子發生。首先，在Drosha的作用下，Mrhl可被剪接成一個80 nt大小的中間體RNA，這些RNA位于GC1精原細胞系的細胞核內，可能與染色質相互作用[13]。其次，Mrhl通過與 Ddx5/p68蛋白相互作用實現負調控Wnt信號通路，這個信號通路在哺乳動物精子發生至關重要[14]。當Mrhl的表達下調時，酪氨酸磷酸化的p68蛋白從核內轉運到胞質中，使β-連環蛋白(β-catenin)向核內移位并且活化關鍵轉錄因子TCF4，形成β-連環蛋白-TCF4復合物，其與目標基因啟動子的Wnt反應元件(Wnt responsive elements，WRE)相結合，通過招募共激活因子(co-activators)或共抑制因子(co-repressors)調節相關基因表達。由于Wnt信號通路能夠導致細胞分化，抑制細胞增殖，因此Mrhl在精原細胞的分裂和分化調控中發揮重要作用[15]。這些研究表明Mrhl對精原細胞的分裂和分化至關重要。仍需要對基因敲除小鼠進行進一步的研究，以確定Mrhl在精子發生中的調節作用。

1.3 Dmr

Dmr是一種過表達于睪丸的lncRNA，其基因位于小鼠5號染色體的G2位點和大鼠12號染色體的p11處。張等[16]研究發現，Dmr基因能夠與來自小鼠19號染色體的Dmrt1(Dsx-and Mab3-related transcription factor-1)基因反式剪接，形成新的Dmrt1-Dmr嵌合轉錄物，該轉錄物編碼一個羧基末端改變的蛋白質。在原代支持細胞培養物中過表達Dmr增加了這種改變形式的Dmrt1蛋白的豐度，降低了Dmrt1亞型的豐度，并導致Dmrt1靶基因的表達受損，模擬了Dmrt1功能表型的喪失[17]。很明顯，反式剪接對Dmrt1有負調控作用；但不清楚的是，非典型亞型是否具有自身的調控活性。Dmrt1是一種保守的轉錄因子，可以通過上調精卵發生特異表達螺旋-環-螺旋轉錄因子1(spermatogenesis-and oogenesis-specific basic helix-loop-helix 1，Sohlh1)以維持支持因子的周期性表達來促進精原細胞發育，也可以通過抑制維甲酸(retinoic acid，RA)依賴性的視黃酸激活基因8(stimulated by retinoic acid gene 8，Stra8)因子的表達，從而間接抑制RA的轉錄以阻止精原細胞過早減數分裂[18]。Dmrt1在包括人類在內的多種脊椎動物和無脊椎動物物種中被認為與性別決定有關，并同時作為轉錄抑制因子和激活因子[17]。通過特異性敲除支持細胞中的Dmrt1基因，發現Dmrt1基因能夠通過影響支持細胞的成熟而影響精子發生[19]。由此可見，Dmr可通過調節Dmrt1來影響精母細胞的發生與發育。雄性超甲基化(male hypermethylated，MHM)是與家禽Z染色體相關的基因座，在雄性生殖細胞中被甲基化并在轉錄上沉默，但在雌性生殖細胞中甲基化程度較低并轉錄成長鏈非編碼RNA。在雄性動物中，MHM過表達會降低決定睪丸的基因Dmrt1的表達，導致胚胎死亡率增加[20]。但目前尚不清楚這些對比結果是由于特定分析系統的特殊性，還是反映了Dmr控制的調節范圍。

1.4 其 他

越來越多的lncRNAs被發現與精子發生緊密相關，并參與雄性生殖細胞增殖、分化的調控過程，如在精子成熟過程中發揮調控作用的lncRNA HongrES2[6]，對精原干細胞多能性和分化產生影響的lncRNA AK052984、lncRNA AK011429、lncRNA AK005651、lncRNA AK028326，對精原細胞分化產生影響的Spga lncRNA1和Spga lncRNA2，對精母細胞減數分裂產生影響的lncRNA Kcnqlot1和Air[21]。雖然在精子發生的特定階段有少數lncRNAs 的調控功能已得到確定，但還有很多與雄性生殖相關的lncRNAs及其具體的作用途徑和機制有待闡明。

2 調控雌性動物生殖的lncRNAs

雌性生殖生物學的發生發展是一個復雜的、多基因參與的過程，涉及到生殖嵴的發育、卵子發生、卵子成熟、卵子激活、胚胎發育等一系列生殖生物學事件[22]。隨著高通量測序及基因芯片技術的發展，研究發現越來越多的lncRNAs如Gtl2、核富含豐富的轉錄本1(Nuclear paraspeckle assembly transcript 1，Neat1)和母本印記表達轉錄本H19(imprinted maternally expressed transcript，H19)等在雌性生殖生物學發展進程中扮演著重要角色。

2.1 Gtl2

Gtl2是母本表達的長非編碼RNA，位于鼠類12q染色體，其人源同系物Meg3基因在2000年被首次發現，定位于人類14號染色體14q32.2，長度約為1.6 kb(GenBank NR-002766)[23]。基因結構分析顯示Meg3由10個外顯子組成，并且可以通過可變剪切產生多種轉錄本[24]。在哺乳動物中，DNA甲基化(DNA methylation)是一種關鍵的表觀遺傳修飾形式[25]。在小鼠的研究中發現，母源Dlk1與Gtl2基因間差異甲基化區域 (intergenic differentially methylated region，IG-DMR)發生去甲基化，可促進lncRNA Gtl2的轉錄[26]。而lncRNA Gtl2可通過一些潛在的機制，如抑制DNA甲基化轉移酶的作用或招募DNA去甲基化因子(如Tet蛋白)等，使得 IG-DMR 處于非甲基化的狀態，導致Dlk1與Gtl2基因在不同親本中差異性表達，從而參與基因組印記的調節[27]。Dlk1-Gtl2印記位點位于小鼠12號染色體遠端，由多個母系表達的lncRNA和多個父系表達的蛋白編碼基因組成，這個位點的印記在胚胎發育和產后生長中起著至關重要的作用[26]。且對于Gtl2表達模式的研究多集中于小鼠，在小鼠中，Gtl2在胚胎發育中具有時空特異性和組織特異性表達，亞細胞定位多見于細胞核，Gtl2在小鼠E3.5 d即出現表達并且為印記表達[28]。2010年，哈佛醫學院研究組敲除Gt12第一外顯子到第五外顯子共5 kb區域進行了研究試驗[26]。結果發現，母本Gtl2缺失導致小鼠圍產期死亡和骨骼肌缺損，提示Gtl2在胚胎發育中起重要作用。同時母本Gtl2缺失也完全阻斷了下游母系表達基因的表達，導致IG-DMR甲基化。相比之下，父系遺傳缺失沒有這種效果。這些數據有力地表明，Gtl2及其下游母本基因的激活在調節Dlk1-Gtl2印記中起著重要作用，可能是通過維持IG-DMR的活性狀態。另有研究表明，Gtl2位點5'端的插入突變也會造成這一區間印記丟失[29]。研究中DNA甲基化是否在Gtl2表達調控中發揮主要影響作用及其調控的具體作用機制仍有待闡明。

2.2 Neat1

Neat1是一個長鏈非編碼RNA，其在小鼠中的轉錄本長度約3.2 kb。目前的研究主要發現其參與旁斑結構的形成并且能與其他的蛋白質-RNA復合體共同參與修飾和加工處理編碼蛋白質基因的轉錄本等生物學過程[30]。目前，在人的胚胎干細胞里的研究結果顯示，Neat1主要通過RNA與蛋白質形成的復合體結構來發揮功能。研究發現在未分化的人源胚胎干細胞中，Neat1缺乏且無法形成旁斑,Lin28(該基因對于維持干細胞多能性具有重要作用)可以在轉錄之后快速出核，翻譯產生干細胞維持所需要的Lin28蛋白質，而在分化過程中，Neat1通過形成旁斑這一亞核結構將Lin28mRNA滯留在亞核區，阻礙其出核翻譯表達，表明Neat1具有調控人源胚胎干細胞的命運決定的重要作用[31]。Nakagawa等[32]發現排卵正常的Neat1敲除小鼠是隨機性不孕，單側移植野生型卵巢或黃體酮改變了表型，表明黃體功能障礙和低水平黃體酮是導致生育率下降的主要原因。盡管Neat1在大多數成人組織中表達微弱，但在黃體中高度表達。然而，近半數Neat1基因敲除小鼠的黃體組織嚴重受損[33]。Hupalowska等[34]研究發現在哺乳動物早期發育階段，合子中母本和合子Neat1 RNA的缺失導致16至32細胞階段的發育停滯，同時它的旁斑p54nrb的缺失也會導致16至32細胞周期的停滯，這與p54nrb基因敲除的胚胎致死率一致。Neat1受一種負性細胞周期調節劑p53的調控，研究從27名反復流產(recurrent miscarriage，RM)患者和配對的健康對照組中檢測出6種候選lncRNA在絨毛組織中的表達，發現這些lncRNA的表達已被p53調節，而且RM患者組織樣本中的Neat1水平顯著降低[35]。這些結果提示Neat1對黃體形成和處于亞健康狀態的妊娠至關重要。

2.3 H19

LncRNAH19是母源等位基因中表達的印記基因，過表達于人胚胎發育階段，出生后表達下調，僅在骨骼肌和心肌中微量表達。H19是miRNA-675的前體，與胰島素樣生長因子2 (insulin-likegrowthfactor-2，IGF2)反義。H19 lncRNA通過miRNA-675反式調控骨骼肌的分化和再生[36]。最近一項研究分析了H19在人滋養層細胞中的過度表達，并用CCK-8技術檢測了細胞增殖。然后，用基質試劑通過transwell法檢測H19對人滋養層細胞的侵襲能力。逆轉錄聚合酶鏈反應顯示，lncRNA-H19在早期自然流產患者絨毛組織和人工流產患者絨毛組織中過表達。此外，lncRNA-H19的上調抑制了HTR8/SV新滋養層細胞的增殖，lncRNA-H19的過表達表明HTR8/SVneo滋養層細胞的運動能力降低。LncRNA-H19抑制早期胎盤生長和早期營養層細胞，可能導致早期自然流產[37]。胎兒生長受限(fetal growth restriction，FGR)的嬰兒圍產期發病和死亡的風險較高，H19基因在胎盤絨毛中大量表達，其在妊娠晚期調控組織病理學異常反應中起重要作用[38]。纖維組織可能導致一些子宮內膜異位相關癥狀的起源，如慢性盆腔疼痛和不孕。H19/miR-216a-5p/ACTA2通路的改變可能介導了子宮內膜基質細胞(endometrial stromal cells，ESC)的侵襲和遷移，研究發現子宮內膜異位癥患者的H19和α平滑肌肌動蛋白(actin alpha 2，ACTA2)水平明顯高于對照組，且子宮內膜異位癥患者的H19和ACTA2水平呈正相關。熒光素酶檢測表明，H19通過競爭抑制miR-216a-5p結合位點來調控ACTA2的表達[39]。這些研究表明H19在滋養層細胞的生殖及運動能力與胚胎發育中起調控作用，具體的分子機制仍需進一步研究。

2.4 其他

目前報道的其他與雌性生殖有關的lncRNAs還有：在妊娠后動物乳腺的發育及泌乳過程產生影響的lncRNA Pinc[40]，在卵巢發育過程起作用的lncRNA lncov1、lncRNA647、lncRNA147和lncRNA274，對卵母細胞成熟和胚胎發育產生影響的lncRNA AK124742[41]，和在山羊初情期中特異性表達的lncRNA XLOC_777127、lncRNA XLOC_113511、lncRNA XLOC_446331[42]。目前這些lncRNAs的了解主要來自測序，有些僅證明與表型相關，對生殖活動方面的調控功能以及具體機制仍需進一步研究證實。

3 展 望

綜上所述，目前已發現許多對調控精子發生、減數分裂、胚胎發育等生殖方面都有重要作用的lncRNAs。但有關調控生殖功能的lncRNAs研究才剛剛起步，仍有很多問題需要闡明：(1) 對lncRNA的研究主要集中于人和小鼠方面，與家畜繁殖相關的 lncRNA方面涉及較少；(2)生殖相關方面的 lncRNAs需進一步拓展；(3)一些具有調控生殖功能的lncRNAs具體作用途徑和機制仍不清楚；(4)很多新發現與生殖有關的lncRNAs調控機制仍需進一步探討。